激光共聚焦法检测外源性TFPI-1与大鼠MsC膜上TF的结合情况

激光共聚焦法检测外源性 TFPI-1 与大鼠 MsC 膜上 TF 的结合情况   外源性加入组织 因子途径抑制物-1(tissue factor pathway inhibitor-1，TFPI-1)能够诱导大鼠肾小球系膜细胞发生凋亡。TFPI-1是组织因子(tissue factor，TF)的天然抑制物，TFPI-1的Kunitzl结构域能与TF-Ⅶa复合物结合。通过免疫荧光检测发现大鼠肾小球系膜细胞膜上有TF的表达。TF作为一种跨膜蛋白介导多条信号转导通路，从而引起细胞增殖。因此推测TFPI-1可能与肾小球系膜细胞膜上TF相结合，抑制TF介导的细胞增殖信号通路，引起大鼠’肾小球系膜细胞凋亡。这种推测用激光共聚焦的方法来加以证实。       1．材料     (1)培养在盖玻片上融合程度达到60％一70％的细胞。     (2)兔抗TFPI-1多克隆抗体、小鼠抗TF单克隆抗体，FITC马抗鼠IgG，TRITC羊抗兔IgG。     (3)冷丙酮固定液(一20~C预冷20min)。 (4)0．01mol／LPBS缓冲液。       2．染色方法     (1)取出培养有细胞的盖玻片，0．01mol／LPBS洗2～3遍。     (2)力口人0．3％TritonX-100，37~C，30min。     (3)加入冷丙酮4℃固定10min。     (4)滴加一抗，兔抗TFPI-1多克隆抗体1：50，小鼠抗TF单克隆抗体1：50，37C孵育1h。抗体以0．01mol／LPBS稀释。     (5)0．01mol／LPBS洗5minX 3次     (6)加入TRITC-羊抗兔IgGl：50，37℃，孵育1h。     (?)0．01m01／LPBS洗5minX 3次。     (8)加入FITC-马抗鼠IgG，1：50，37℃，孵育1h。     (9)0．01mol／I。PBS洗5minX 3次。     (10)90％甘油(PBS配制)封片。 (11)激光扫描共焦显微镜下观察。       3．结果     TFPI-1和TF均能产生荧光，但两者不能重叠。因此在大鼠肾小球系膜细胞膜上两者不发生结合，TFPI-1引起的大鼠肾小球系膜细胞凋亡不是通过TF实现的。 激光共聚焦法检测外源性TFPI-1与大鼠肾小球系膜细胞膜上9V的结合情况 注：A,B为对照组；D为TP；E为TFPI-㈠C．F为激光共聚焦