免疫印迹法检测MAPK信号通路表达改变

免疫印迹法检测 MAPK 信号通路表达改变

肾小球硬化的主要发病机制之一是细胞外基质(ECM)的异常沉积。转化生长因子p1(TGF-B1)在ECM沉积中起作用，并与MAPK信号通路有密切关系。醛糖还原酶(AR)是多元醇代谢通路中的限速酶，研究证实AR基因为大鼠肾小球肾炎及肾脏硬化过程中系膜细胞 (MsC)的TGF-6l反应性基因之一。以蛋白质印迹检测正常MsC、AR转基因MsC、应用醛糖还原酶抑制剂索比尼尔(sorbinil)和哇泊司他(zop01restat)分别孵育的MsC在TGF-p1刺激前后MAPK／磷酸化MAPK表达的变化。

1．方法

(1)培养细胞后提取细胞总蛋白。

(2)配置10％分离胶和5％堆积胶，进行SDS-PAGE变性电泳。

(3)转膜后，以5％脱脂奶粉封闭，2～3h。

(4)加一抗：兔抗ERK／磷酸化ERK抗体、兔抗JNK／磷酸化JNK抗体、兔抗P38／磷酸化P38抗体(均为1：800)，2～3h。

(5)TTBS洗膜，5minX 3次。

(6)加二抗：HRP标记的羊抗兔IgG(1：1 000)，1h。

(7)TTBS洗膜，5minX 3次，

(8)DAB显色。

2．结果

正常MsC组(泳道1，A-C)和空载转染组(泳道2，A～C)，丁GF-F1作用后能激活MAPK信号通路。AR活性被抑制或AR过表达对TGF-F1诱导的ERK的激活无作用(A)。AR活性被抑制后能显著降低JNK的磷酸化，抑制JNK活性，而AR过表达则能增强JNK的活性(B)。同样AR活性被抑制后能显著降低P38的激活，但AR过表达对P38的激活无作用(C)。

蛋白质印迹检测TGF-p1刺激前后AR对MsC内MAPK信号通路的影响

注：泳道1为正常Mst组；泳道2为MsC空载转染组；泳道3为索比尼尔作用于正常MsC组；泳道4为哇泊司他作用于正常MsC组；泳道5为AR转染MsC组