噬菌体多肽展示文库及其新药研究中的应用

一、概况

噬菌体展示技术（Phage Display Technology）在80年代中期产生， Smith G第一次描述了在丝状噬菌体表面展示外源多肽片段的原理。

该办法主要是用DNA重组技术将大量的多肽编码顺序导人噬菌体的衣壳蛋白基因中，从而使表达出的各种多防以与PIII或PVIII蛋白融合的形式出现在噬菌体的表面，即首先构建噬菌体多肽展示文库。10多年来在构建噬菌体展示多肽文库方面以及用生物学方法－biopanning从该文库中筛选出与已知靶物质相结合的多防编码顺序方面取得了巨大的进展。

近年来，在识别蛋白或受体的小肽顺序的鉴定上、在结构和功能上模拟已知蛋白的多肽模拟物的研究上、在筛选鉴定能与人类病毒、细胞、组织及肿瘤等生物靶系统结合的多肽研究日益增加。

噬菌体多肽展示库提供了这样的可能胜：可从多肽展示库中分离出一个能与重要蛋白如与炎症有关的抗体、与介导细胞粘着的整合蛋白等特异性结合已具有相应生物活性的多肽。

特别是有可能发现一些多助配基而导致多肽模拟药物（peptidomimetic drugs）的产生。噬菌体及库有广泛的应用，它不仅可以展示小肽，而且可以展示较大的蛋白，如单链抗体。

丝状噬菌体是在菌毛阳性的细菌中繁殖的，它不造成细菌的裂解，而可使细菌分泌出多拷贝的，在其表面展示出插入顺序的噬菌体。结合到一个靶分子上的噬菌体可以被洗脱下来，然后又在细菌中生长扩增。这就是所谓生物锅（biopanning），重复多次就可以富集结合到靶分子上的有关噬菌体。

有关结合性多肽顺序可以通过编码该多肽的噬菌体基因组部分的核苷酸顺序的测定完成。最后插入的多肽顺序可以用重组技术或人工合成的方法再造，通过这种方法可以发现目标受体的特异的和选择性的配基。

在展示文库中，多防顺序被融合在最小的衣壳蛋白III的氨基端内或其附近。另一个较小程度被应用的融合对象是大的衣壳蛋白VIII。应用pIII的好处是相当大的多肽或蛋白的插入并不导致噬菌体感染力的丢失。

在每一个噬菌体颗粒上只有大约5个拷贝的pIII被锚定在噬菌体的顶端。如应用FUSE 5载体时每个pIII上都有一个插入顺序，因此是一个多肽的多价显示。过去数年来的报道表明，在体内和体外应用这个载体发现的不同靶分子的多肽配基时，多价显示并不是一个必要的条件。

噬菌体颗粒令人惊异地能耐受苛刻的环境条件，如在pH 2.2和4-6M。

尿素的条件下而不丧失感染细菌的能力，这种特点被用来解聚靶分子和噬菌体的结合。需要注意的是结合在靶上的噬菌体并不必非从64孔板或组织上洗脱下来，通常可直接将细菌加入到64孔板或匀浆的组织中，铺极后即可获得有关噬菌体。

如果受体、配基作用的生物化学的细节已知的话，更特殊的一些方法也可用于洗脱。如含精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）的多肽和阳离子螫合剂如 EDTA则以使结合到 α5β1上的噬菌体解离。

二、识别短肽顺序的蛋白和受体

一旦某个蛋白可以获得纯化或者转染后在细胞表面表达该蛋白，那么多肽文库就提供出一种可能性，去定性特异性结合到那个蛋白上的配基。在活细胞中蛋白一蛋白间的反应常常由相当大的表面积外导，但也有的只与一小段肽的结合有关。

噬菌体展示多肽文库特别适宜研究队指导下的分子间反应。噬菌体多肽展示文库最重要的应用就是确定抗体的抗原决定簇。抗体能识别小肽通常仅基于3－4个保守的氨基酸。噬菌体展示揭示出的多肽，描绘出被抗体识别的蛋白区是可能的。牵涉到自动免疫失常的抗体的决定簇的确定可能对疾病的免疫机制给予重要的信息。

噬菌体展示的一个多肽也可以反向应用去产生一个抗展示的多肽的抗体。丝状噬菌体是一个非常强的免疫原，由它可以分离出一个特殊的噬菌体展示的多肽的抗体。

在免疫系统中存在着一些可以识别小肽的分子。主要的组织相容性分子（MHC）的功能就是识别在宿主的细胞表面上的来源于内源和外源的蛋白。当一个细胞变得不正常，或者被有害的微生物侵入宿主时，基于结会到MHC分子的多肽顺序，免疫系统可以识别。噬菌体展示文库一直被用来描述每一种MHC分子所识别的多肽结构。

细胞表面整合蛋白家族可以识别三防RGD。这些整台蛋白介导细胞粘附多种含有RGD的细胞外的基质蛋白，例如纤维粘连蛋白，vitronectin和fibyiflogen。筛选噬菌体展示库已经证明整合蛋白α5β1、αLib、β3、αvβ3、αvβ5当中每一种都有略微不同的肽段的特异结合性，而且乐于结合独特的环状二硫键顺序中的RGD的多肽。

这反映出每一种整合蛋白对不同胞外蛋白的不同的嗜好性。已发现筛选出的结合。α5β1的多肽含CRGDGWC顺序，而对αvβ5的结合多肽有更为复杂的结构CDCRGDCFC（又称RGD－4C），这个整合蛋白结合多肽含有4个半脱氨酸，这些半眈氨酸的配对可形成不同二硫键的混合物。由半胱氨酸随机氧化而合成制备的双环多肽的活性足以导致细胞的粘连，后来的实验又证明另一种二流键的排列能给出更具活性的多肽。

用噬菌体展示多肽常常揭示出新的不曾料到的多肽配基。用α5β1整合蛋白可筛选出一个环形的多肽CRRETAWAC，它反过来又是这种整合蛋白特异的配基，而不与整合蛋白家族的其他成员结合。这个多肽能防止α5β1介导的细胞对纤维粘连蛋白的粘连。

另外一种整合蛋白结合的是NGR，几乎是RGD的反向顺序。NGR顺序出现在许多蛋白的顺序中，如纤维粘连蛋白，但它对整合蛋白只有相当低的亲和力。NGR在墓质蛋白和整合蛋白反应中的作用还不清楚。

噬菌体展示文库也常用来选择并不识别RGD或NGR，但能识别其它基质蛋白的整合蛋白的配基，如α6β1，（一种膜层蛋白）和αMβ2（一种免疫球蛋白样的粘和蛋白的白细胞受体）。

能以两种假性对称方式I和II之一种结合Src同源区III（SH3）的配基也用噬菌体展示研究过。SH3存在于许多蛋白激酶中，并结合信号分子的脯氨酸富集区。

I型的保守顺序是RPLLPPLP，而II型是反方向肋APPLPPR。蛋白中出现的脯氨酸富集区与激酶反应，卷入了信号传导。多肽文库也用来发现另一个蛋白激酶和信号传导蛋白的共同区SHZ的配基。SHZ区识别一个含有磷酸化的酪氨酸的多肽。