小鼠小肠类器官培养方案
一、组织提取
1. 动物房中取C57 6-8周小鼠，采用颈椎脱臼法处死后，从腹部剖开。
2. 从胃贲门后约2 cm处开始，取6-8 cm的小肠，放入含有PBS的培养皿中。
3. 小心去除小肠外壁的肠系膜。
4. 用灌胃针从小肠一端注入PBS，清洗小肠内容物，两端各重复2-3次。
5. 将小肠置于在离心管中，用含1%双抗的PBS清洗两次，每次上下颠倒震荡后更换新的PBS。
6. 在培养皿中加入含双抗的PBS，将小肠放入后，剪去两端部分，然后从中间剖开，展开后剪成约2 cm的片段。
7. 将得到的小肠片段加入含1%双抗的PBS中，剧烈震荡一次后，再缓慢震荡，不断更换PBS清洗直至溶液不再浑浊（一般重复5-6次）。清洗两次后，观察溶液中游离小肠绒毛的数目，以确定小肠的状态。
8. 取20 mL含1%双抗的PBS，加入0.1%胶原酶I和1 mM EDTA，将小肠片段放入其中，冰上消化25 min。同时取两支15 mL离心管，用1%的BSA润洗后备用。
9. 消化完成后，弃去消化液，加入新的PBS大力摇晃，以洗脱部分容易脱落的绒毛。然后更换PBS，轻轻摇晃直至溶液澄清。
10. 将盖玻片洗净，依次用ddH2O、酒精和PBS冲洗。
11. 在加有PBS的培养皿上，用盖玻片将小肠隐窝刮下，注意力度适中。
12. 用PBS将玻片上的隐窝冲到50 mL离心管中，并取样在显微镜下观察隐窝状态和大概的数目。
13. 100×g，4℃离心1 min。
14. 弃上清，用20 mL PBS重悬，并取样观察。
15. 将上一步得到的细胞悬液用经1% BSA润洗过的100 μm滤网过滤，收集滤液后，以69×g，4℃离心5 min。
二、类器官培养
1. 弃上清，用5 mL的小鼠小肠类器官培养基重悬沉淀，然后转移到15 mL离心管中，以69×g，4℃离心5 min。
2. 计数后，转至超净工作台操作，弃上清，根据沉淀量，使隐窝密度约为8-10个隐窝/μL，按3:7的比例加入培养基与基质胶（PB180536）混合液。注意在冰上操作，防止基质胶凝固，用1 mL移液枪轻轻混匀。
3. 将30 μL含有隐窝的基质胶混合液轻柔地加入预热的24孔板中，避免枪头触碰到孔板底部。
4. 将种好的24孔板置于37℃、5% CO2培养箱孵育10-20 min，使基质胶完全凝固。
5. 待基质胶凝固后，每孔加入500 μL小鼠小肠类器官完全培养基，继续在37℃、5% CO2培养箱中培养。
6. 每隔3天更换一次培养基。通常在培养5-7天后，根据类器官的生长情况，可按1:2或其他适当比例进行传代。
所用类器官培养基如下：
产品名称 | 货号 | 使用浓度 |
Advanced DMEM/F12 | PM153312 | N/A |
B-27神经细胞添加剂（50×），不含维生素A | PB180638 | 1× |
N-2 添加剂（100×） | PB180641 | 1× |
N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）溶液（0.5 M） | PB180601 | 1.25 mM |
R-spondin 1/RSPO1, Human, Recombinant | PCK214 | 500 ng/mL |
EGF/Urogastrone/URG, Mouse, Recombinant | PCK002 | 50 ng/mL |
Noggin/NOG (N-8His-Flag), Human, Recombinant | PCK211 | 100 ng/mL |
HEPES液（1 M） | PB180325 | 1× |
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（GlutaMAX）（200 mM），100× | PB180419 | 1× |
青霉素-链霉素溶液（双抗），100× | PB180120 | 1× |
三、类器官传代
1. 计算与准备：首先计算胶滴中类器官的数量，每个新胶滴应包含约50-200个类器官。根据此数量，计划传代所需的胶滴数量。
2. 收集类器官：吸去培养基，加入1-2 mL左右预冷至4℃的类器官传代培养基，轻柔吹打，使基质胶充分分散。
3. 吹打分散：继续轻柔吹打，将类器官分散成较小的细胞团或碎片。
4. 洗涤：将吹打后的类器官收集至15 mL离心管中，加入Advanced DMEM/F12培养基至6-8 mL（培养基越多，基质胶被稀释得越充分，越容易去除）。
5. 离心收集：300×g，离心5 min，弃去上清，收集沉淀的类器官。
注：若类器官体积较大，难以通过吹打充分吹散，可采用消化法辅助分散。
1. 消化处理：接步骤1（计算与准备），将培养类器官的24孔板从培养箱中取出，用移液器吸去培养基。每孔加入0.5-1 mL类器官消化液，使用1 mL移液枪头轻柔吹打，使胶滴充分分散（根据类器官数量可适当增加类器官消化液的用量）。将培养板置于室温下消化5-8 min，或放入37℃培养箱中消化3-5 min。密切观察消化情况，当出现大量细胞团时即可终止消化，避免过度消化影响类器官活性和生长。
2. 类器官收集：将消化后的类器官悬液转移至含有6 mL预冷的Advanced DMEM/F12培养基的离心管中，确保培养孔中的类器官被完全收集。以300×g离心5 min，弃去上清，保留沉淀中的类器官。
3. 接种：根据类器官计数结果，将细胞沉淀重悬于基质胶中。提前将24孔板置于37℃预热至少30 min。每孔接种30 μL类器官悬液，胶滴应尽量接种于孔中央，避免接触孔壁。将接种好的培养板放置在37℃孵育10-15 min，以待基质胶完全凝固。
4. 培养与换液：待基质胶凝固后，使用移液枪沿孔壁向每孔中缓慢加入500 μL预热的胃类器官培养基，避免冲散胶滴。对于未接种类器官的孔，可加入适量PBS以保持培养环境的湿度。将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。建议每2-3 d更换一次新鲜培养基。定期观察类器官生长情况并拍照记录，直至下次传代。
图1. 显微镜下观察不同代次小肠类器官形态（左：P0；右：P1）
四、类器官冻存
1. 类器官收集：小心吸去培养孔中的培养基，加入1-2 mL Advanced DMEM/F12培养基，轻柔吹打，使基质胶充分分散，将类器官悬液收集在15 mL离心管中。
2. 洗涤：向离心管中加入适量Advanced DMEM/F12培养基，定容至6-8 mL（培养基用量越多，基质胶被稀释得越充分，越容易去除）。
3. 离心：以300×g，离心5 min，弃上清及残留的基质胶，保留沉淀中的类器官。
4. 冻存：加入适量类器官冻存液，轻柔重悬沉淀，确保混合均匀。将重悬后的类器官分装至标记好的冻存管中，每管1 mL。将冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，次日转移至液氮罐中长期保存。建议冻存密度为每1 mL约500个类器官。
五、类器官复苏
1. 从液氮罐中迅速取出冻存管，立即投入到已预热至37℃的水浴锅中解冻1-2 min，期间不断轻轻摇动，使冻存液迅速融化。
2. 将解冻后的含有类器官的冻存液转移至15 mL离心管中，加入6-8 mL类器官传代培养基重悬，轻柔吹打混匀6-8次，300×g、4℃离心5 min，弃上清。
3. 基质胶重悬类器官沉淀，轻轻混匀。将24孔板提前预热30 min，每孔加入30 μL类器官悬液，胶滴应尽量位于培养孔中央，避免接触孔壁。
4. 将接种好的培养板放置在37℃培养箱中静置10-15 min，使基质胶充分凝固。
5. 待基质胶凝固后，沿孔壁缓慢加入500 μL传代培养基，避免冲散胶滴。将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中进行培养。
六、小鼠小肠类器官免疫荧光鉴
图2. 构建完成的小鼠小肠类器官免疫荧光鉴定结果图
E-cadherin在所有上皮细胞的细胞膜上连续表达，清晰地勾勒出类器官的完整结构。LYZ是潘氏细胞的特异性标志物，潘氏细胞是位于小肠隐窝底部的一种特化上皮细胞，它们通过分泌溶菌酶、防御素等抗菌肽来调节肠道菌群并保护肠道干细胞。两种标志物免疫荧光鉴定呈阳性表明小肠类器官构建成功。
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