亲和层析制备胰蛋白酶抑制剂

亲和层析制备胰蛋白酶抑制剂

[原理]

鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂，对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用（而对胰凝乳蛋白酶无抑制作用）。

双功能 试剂 β-硫酸脂乙砜基苯胺（SESA）活化珠状交联琼脂糖，重氮化后与胰蛋白酶偶联形成亲和吸附剂，来制备卵粘蛋白。

[方法和步骤]

1、亲和吸附剂——固定化胰蛋白酶的制备

（1）对氨基苯磺酰乙基（ABSE）-琼脂糖制备

①滤干的琼脂糖凝胶12g加入10 mL蒸馏水以1mol/L NaOH溶液调pH至13。

②SESA 0.8g悬于5mL蒸馏水中，搅拌下缓慢用1.5mol/L Na 2 CO 3 溶液调pH至6.0，待溶解后离心。

③把上述二者混合放入沸水浴中，待温度达到60℃时，立即加入Na 2 CO 3 0.25g，继续在沸水浴中维持45min。

④抽滤后用0.5mol/L NaOH溶液洗三次，再用蒸馏水洗三次抽干，即得ABSE-琼脂糖。

（2）ABSE-琼脂糖重氮化

①ABSE-琼脂糖凝胶悬于10mL蒸馏水中，放入冰浴中，搅拌下依次加入预冷的1mol/L HCl 10 mL和5% NaNO 2 溶液10 mL，冰浴中间歇搅拌20min。

②过滤并用预冷的0.05 mol/L HCl洗三次，冷蒸馏水洗三次抽干即为重氮盐衍 生物 。（3）胰蛋白酶的偶联

将ABSE-琼脂糖重氮衍 生物 立即投入10ml/mL胰蛋白酶溶液，立即用1.5mol/L Na 2 CO 3 维持PH8.0，冰浴中间歇搅拌1.5h，再以少量1mol/L NaCl溶液洗二次，蒸馏水洗三次即可得固定化胰蛋白酶。

2、亲和层析纯化卵粘蛋白

（1）装柱

将制得的固定化胰蛋白酶悬浮于约一倍体积的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.5）中，按常规装柱。

（2）平衡

用约50mL的0.1mol/L Tris-HCl，pH7.5缓冲液过柱平衡，流速2mL/min，直至流出液pH与缓冲液一致。

（3）亲和吸附：

取2 mL充分打匀的新鲜鸡蛋清，加入10 mL稀释，用电磁 搅拌器 打匀，过滤后上柱吸附，流速小于3滴/min。

（4）洗涤

用0.1mol/L Tris -HCl，pH7.5 缓冲液 洗柱，流速小于2mL/min，直至流出液A 280 处读数不大于0.05。

再用0.01mol/L pH4.8乙酸 缓冲液 洗涤，流速1mL/min，直至流出液在A 280 的读数小于0.05。

（5）洗脱

用0.05mol/L PH2.5甘氨酸缓冲液进行洗脱，流速小于5滴/min，每管3mL收集，依次测定各管A 280 。将峰值管收集液合并，得纯化的卵粘蛋白。

[结果和计算]

1、以A 280 为纵坐标，洗脱管号或洗脱收集液体积为横坐标，绘制洗脱曲线图。

1、 计算上柱前和洗脱收集所得卵粘蛋白的蛋白质总量，求出蛋白回收率。