细胞早期凋亡检测方法Annexin V

General Annexin V Staining Procedure

备用试剂 1. 结合缓冲液 (10X ): 0.1 M HEPES, pH 7.4; 1.4 M NaCl; 25 mM CaCl2 . 稀释到1X 工作液备用; 2. 碘化丙碇Propidium Iodide (PI). 用PBS稀释到 50 μg/ml备用,建议与Annexin V-FITC联合使用; 3. 7-AAD. 推荐与Annexin V-PE或者Annexin V-Biotin 联合使用; 4. 1X PBS 室温储存备用;

染色步骤 1、用预冷的PBS洗涤细胞两次,之后用1X的结合缓冲液重悬细胞, 调节细胞浓度到1X106Cells/ml; 2、取100μl调节好浓度的细胞悬液到5ml流式管底部; 3、加入Annexin V标记蛋白和相应的核酸染料(标记的Annexin V与核酸染料均需要摸索到合适的使用浓度,商品化试剂盒按照说明书操作); 4、均匀混合,室温避光反应15分钟;(若是用Annexin V-Biotin标记蛋白染色,反应后用1X的结合缓冲液洗涤细胞一次,再加入合适浓度的标记链霉亲和素Streptavidin,再加入合适的核酸染料,室温避光反应15分钟) 5、向流式管中加入400μl 1X的结合缓冲液,重悬后及时上流式细胞仪进行分析.

建议设置对照管 实验中需要设置空白对照管(只加细胞) 和单染调节补偿管(分别用标记的Annexin V和核酸染料做单染管),这些对照管在实验中用来调节仪器补偿和划定Quadrants. 实验中还需要设置同时培养的没有做药物诱导凋亡的对照组管, 还可以加上一组很容易诱导凋亡的细胞对照组, 以证明染色体系没有错误。

操作注意事项(个人经验) 1、补偿对照管很重要; 2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞; 3、细胞浓度与染色用的蛋白量要合适; 4、对不同药物浓度和药物作用时间要进行摸索;