基因拼接SDL法

SDL方法（Gene splicing by directed liga- tion），即直接拼接法，在SOE法基础上又有新的突破： 　　（1）限制性内切酶，EcoRI核酸内切酶（或其它Ⅱs类限制性内切酶）能专一性识别 6bp的非回文序列，并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸，产 生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5'末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关， 而是由切点附近的序列决定的。 　　（2）扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例：5'链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列；3'链引物包括常规3'链引物和AC及EcoRI 识别位点。 　　（3）唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5，它的右 侧突出末端TCAC中，TC为原始exon5的一部分，AC为原始exon6的一部分，且TCAC与 exon6的AGTG互补配对，其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259，故可被视作 “唯一性末端”。 　　（4）把经扩增的exon5、exon6和exon7混合，依据碱基互补配对原则，它们就能按顺 序依次拼接。