考马斯（Comessie)亮兰结合法测定蛋白质浓度

【原理】 考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250 的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮兰G250-蛋白质定量测定的高敏性度。 在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。 【操作】(常量法) (一)标准曲线制备： 配制lmg／ml的标准蛋白溶液。制备系列稀释液，其浓度分别为1000μg／ml，500μg／ml， 250μg／ml，125μg／ml ，62.5μg／ml和31.25μg／ml。 按下表操作： 摇匀，室温静置3分钟。在第一管为对照管，在721型分光光度计于波长595nm处比色-读取光密度。以各管光密度为纵座标，各标准样品浓度(μg／ml)作为横座标作图得标准曲线。 (二)未知样品测定： 取血清0.25ml直接置于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀。(此法样品稀释200倍)。 取试管二只，按下表操作： 摇匀，静置3分钟，在721型分光光度计亡波长595nm比色，读取光密度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白质浓度。 【计算】 未知样品蛋白质浓度μg／ml＝稀释样品浓度×稀释倍数 【优缺点】 (—)操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。 (二)显色迅速。约于2分钟内完成染料与蛋白质的结合。所现颜色至少在l小时内是稳定的。 (三)与改良Lowry氏法相比，干扰物质较少。 (四)当样品中存在较大量的十二烷磺酸钠(SDS)、TritonX-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。 (五)考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。 (六)微量法测定蛋白含量范围为1-10μg；常量法测以检测范围10-100／μg为宜。 【器材】 (一)试管l0支 (二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。 （三）721分光光度法，普通比色杯4只。 【 试剂 】 (一)O.9％NaCl (二)待测血清 (三)标准血清 (四)染液：考马斯亮兰G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85％(W／V)磷酸。然后加 蒸馏 水定容到1000ml。[此时溶液为0.0l％考马斯亮兰G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。