胶体金免疫标记技术-蛋白-金复合体的制备

胶体金免疫标记技术-蛋白-金复合体的制备

一般认为胶体金粒子表面为一层 AuCl2 ，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。

金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于 pH 值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的 pH 值，在 pH=pI 时为中性。由于在 pH=pI 时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为 pH=PI+0.5 ，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。

胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（ 1 ）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（ 2 ）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。（ 3 ）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（ 30 kD ），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如 BSA ，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。

当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳 pH 值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同 pH 值得胶体金结合后，只有某一特定 pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如 NaCl ）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜 pH 范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜 pH 值为最佳 pH 值。但有些探针的实际情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。

在确定最佳 pH 值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（ Blocking ）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。

这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳 pH 也有一定变化。

因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。