甲醇酵母表达系统
甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris 三种，其中Pichia Pastoris 作为基因表达系统使用得最多、最广泛［1］ 。与以往的基因表达系统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。
1. 外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达 目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。尽管各种外源蛋白质产生的水平不一，但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10～100倍［2］ 。如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L，而在甲醇酵母中为450mg/L，提高了60倍［3］ 。椐报道，外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L［9］ 。
表1 外源蛋白质在甲醇酵母中的高效产生
| 外源蛋白质 | 产生量(g/L) | 文献 |
| 转化酶 | 2.3 | ［4］ |
| D-丙氨酸羧肽酶 | 0.8 | ［5］ |
| α-淀粉酶 | 2.5 | ［6］ |
| Kunitz蛋白酶抑制剂(AbPP) | 1.0 | ［7］ |
| 瞬时抗凝蛋白(TAP) | 1.7 | ［8］ |
| 破伤风毒素片段C | 12.0 | ［9］ |
| 百日咳抗原P69 | 3.0 | ［10］ |
| 人免疫缺陷病毒1膜外糖蛋白gp120 | 1.3 | ［11］ |
| 肿瘤坏死因子(TNF) | 10.0 | ［12］ |
| 人转铁蛋白N端 | 4.0 | ［13］ |
2. 实现外源蛋白质高效产生的关键因素 2.1 表达载体 首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX 1)的启动子(PAOX1 )和转录终止子(3′AOX1 )构建成整合型表达载体。PAOX1 是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%［2］ ，所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次，在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体，一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷，另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外，使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体，形成多个表达单元，产生高产的菌株，此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。 2.2 受体菌 在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX 1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高［14］ 。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
3. 应用前景 经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入，它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。
表2 国内利用甲醇酵母产生的外源蛋白质
| 外源蛋白质 | 产生量(g/L) | 文献 |
| 人胰岛素 | 0.25 | ［15］ |
| 人胰岛素原 | 0.3 | ［16］ |
| 人p53蛋白 | 0.2 | ［17］ |
| 辣根过氧化物酶 | 4～6 | ［18］ |
| 人基质金属蛋白酶-9 | 0.01 | ［19］ |
参考文献
［1］李黄金等. 《生物工程学报》，1998，14(4)：337 ［2］戴秀玉. 《微生物学报》，1997，37(6)：483--485 ［3］彭毅等. 《生物技术通报》，2000，(1)：38 ［4］Tschopp JF. Bio/Technology ，1987，5：1305-1308 ［5］Despreaux CW et al. Gene ，1993，131：35--41 ［6］Paifer E et al. Yeast ，1994，10：1415--1419 ［7］Wagner SL et al. Biochem Biophys Res Commun ，1992，186：1138--1145 ［8］Laroche Y et al. Bio/Technology ，1994，12：1119--1124 ［9］Clare JJ et al. Bio/Technology ，1991，9：455--460 ［10］Romanos MA et al. Vaccine ，1991，9：901--906 ［11］Scorer CA et al. Gene ，1993，136：111--119 ［12］Sreekrishna K et al. Biochemistry ，1989，28：4117--4125 ［13］Cregg JM et al. Bio/Technology ，1993，11：905--910 ［14］柴清等.《生命的化学》，1997，17(4)：36 ［15］王燕等.《生物化学与生物物理学报》，1999，15(3)：587--589 ［16］郭永志等.《生物工程进展》，1999，19(6)：64 ［17］邱荣德等.《生物工程学报》，1999，15(4)：477 ［18］蒋太交等.《生物化学与生物物理进展》，1999，26(6)：584 ［19］颜红春等.《中国生物化学与分子生物学学报》，2000，16(2)：194
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