碱性磷酸酶－抗碱性磷酸(APAAP)免疫组化染色技术检测淋巴细胞表

(一)　基本原理 　　APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 技术的基本原理为: 抗鼠IgG抗体作为桥梁，将鼠源性识别细胞 抗原的第一抗体与鼠源性的抗碱性磷酸酶单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物相连接，使之成为Ag，-Ab１－Ab２-anti AP-AP的复合物。还可通过二抗将APAAP 复合物重复叠加起来，从而使多个碱性磷酸酶标记于组织细胞 上第一抗体所识别的抗原部位，提高了敏感性。 　　　　　　　　　　图　　APAAP技术原理 　　(二)　方法 　　 分离外周血单个核细胞 (PBMC)，洗涤后用含10％FCS�PMI1640 调整细胞 浓度约5×10６／ml 　　　　↓ 　　　　　自制制片机上制片，充分干燥 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　用含丙酮-福尔马林固定液中固定30秒钟 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　　自来水、蒸馏水依次冲洗 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　用TBS稀释特异性McAb或阴性对照抗体(1∶50～500)， 　　　　　　　　　　　　　每片加30～50μl 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　室温湿盒孵育30min，或4℃冰箱湿盒中过夜 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　充分用TBS冲洗后，加1∶50羊(兔)抗鼠IgG 　　　　　　　　　　　　(GAM或RAM IgG)30～50μl 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　　　室温湿盒孵育30min 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　TBS冲洗后加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(1∶2000)复合物(APAAP) 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　TBS冲洗后可重复叠加GAM或RAM IgG和APAAP2次，每次孵育10min 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　冲洗后底物液显色10～15min 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　自来水冲洗，苏木精衬染，光镜下观察 　　(三)　试剂器材 　　载玻片，制片机，湿盒，光学显微镜 　　1.　APAAP配制：牛肠碱性磷酸酶Ⅶ型(Sigma)4.3μl或粗酶2mg溶于1ml 0.05M,PH7.6的TBS，加抗碱性磷酶单克隆抗体腹水2μl制成，临用时作1∶2～1∶4稀释。 　　2.　AP底物配制：Naphathol(萘酚)AS-MX(Sigma) 25mg溶于1ml二甲基甲酰胺，加PH8.2, 0.1M Tris-HCl缓冲液49ml，再加Fast Red ITR (Sigma) 50mg，充分混匀，用前配制。必要时加12mg Levamisole以抑制内源性碱性磷酸酶。亦可按上述比例少量配制。 　　3.　丙酮-福尔马林固定液：4℃保存 　　　　100mg Na２HPO４ 　　　　500mg KH２PO４ 　　　　150ml H２O 　　　　225ml Acetone 　　　　125ml Formalin

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