葡糖氧化酶法测血糖浓度

【实验目的】

1. 熟悉定量的基本操作，练习使用定量的计量 仪器 。

2. 掌握分光光度计的使用。

3. 掌握比色法原理。

4. 掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理和方法。

【实验原理】

（一）比色分析法

比色分析法是通过比较有色物质溶液颜色的深浅，来测定该物质浓度的方法。有些被检测的物质溶液本身就具有颜色，而有些物质虽不具有颜色，但可于试样中加入某种适宜的试剂，使其产生有色化合物。溶液颜色的深浅与试样中该化学成分的含量成正比。借助于光电比色计和分光光度计，将未知含量的有色溶液和已知含量的有色溶液进行比色，通过计算就可求出未知溶液的含量。

其基本原理根据Lambert定律和Beer定律，比色分析法的计算公式亦由此二定律推衍而得。

Lambert定律 ：一束单色光线通过一有色溶液后，由于溶液吸收了一部分光，所以光线的强度就要减弱。当溶液浓度（C）不变时，光透过的液层越厚，则光线的减弱就越显著。

若 I 0 =光线通过溶液前的强度（入射光强度）；

I =光线通过溶液后的强度（透过光强度）；

L =溶液的厚度；

而 I/I 0 =表示光线透过溶液的程度，称为透光度，用 T 表示。则 T = I/I 0 。

Lambert定律证明，- lg I/I 0 ∝ L ，即-lg T ∝ L

写成等式为- lg I/I 0 = K 1 L/>

-lg I/I 0 = lg I 0 /I ,故上式可写成lg I/I 0 = KL

令lg I 0 /I为吸光度（ A ）,或称为消光度（ E ），或称光密度（ OD 或 D ），所以

A= K 1 L/> ……………………………………………(1)

由（1）式可知，当溶液的浓度不变，溶液的吸光度（ A ）与溶液液层的厚度成正比，这就是Lambert定律。

上式中的 K 1 为常数，其数值与入射光的波长、溶液的浓度及性质有关。

Beer定律：一束单色光通过一有色溶液后，若溶液的厚度不变，其透过光的强度与溶液的浓度（C）有关，溶液的浓度越大，则透过光的强度越弱，他们的关系为：

- lg I/I 0 ∝C，-lg I/I 0 = -lg T = lg I 0 /I =A

故A∝C，写成等式为

A= K 2 C/>………………………………………………(2)

K 2 亦是常数，其数值随入射光的波长和溶液的性质而改变。

合并上述（1）（2）两式，得

A=KCL………………………………………………(3)

这就是Lambert-Beer定律，即溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

在比色分析中，在相同条件下对两个性质相同而浓度不同的溶液进行测定，一个为已知浓度的标准溶液，一个为未知浓度的溶液。

设：C 1 为标准溶液的浓度；

C 2 为未知溶液的浓度；

A 1 为测得的标准液的浓度；

A 2 为测得的未知液的浓度。

按（3）式，则

A 1 = K C 1 L /> ; A 2 = K C 2 L /> 2

移项得 A 1 /C 1 = KL 1 A/> 2 /C 2 = KL 2

在使用光电比色计或分光光度计时，溶液放在固定的比色杯中进行比色，故 L 1 = L 2 ，又因为是同一溶液， K 值相同，上两式的左式相等，故

A 1 /C 1 =A 2 /C 2

移项得

C 2 =A 1 /A 2 ×C 1 …… ……………………………… (4)

(4)式是比色分析中常用的重要公式，只要再乘以样品的稀释倍数，就可求得该物质的含量。在以后的实验中要经常用到它，须牢记。

（二） 721 型分光光度计的使用方法

1. 使用前应检查 仪器 各部件是否正常，各旋钮应位于起始位置。

2. 检查电源电压是否与仪器要求相符。

3. 接通电源，打开比色槽暗箱，调节0电位钮，使电表指针位于透光度（ T ）于0处，预热10min。

4. 旋动波长选择钮，选择适当波长。用灵敏选择钮选择相应的放大灵敏度（灵敏选择钮先调1档，如调不到0，则再逐步增加高档）。

5. 取3只比色杯，分别装入空白液，标准液和测定液，依次放比色槽内。

6. 盖上比色槽盖，将空白管置于光路上，调节100电位钮，使指针指到透光度100处。

7. 打开比色盖，将指针回到0位，再盖上比色槽盖看指针是否到100处。如调节好后，0电位钮和100电位钮就不可再随意转动。

8. 拉动比色杯拉杆，依次将标准液和测定液对准光路，分别读出吸光度数。

9. 使用完毕后，将0电位钮和100电位钮恢复到起始位，切断电源。

10. 清洗比色杯，倒置于滤纸上晾干，以供下次使用。

（三）葡糖氧化酶法测血糖浓度

血液中的葡萄糖称为血糖，是糖在体内的运输形式。血糖浓度受神经系统和激素的调节而保持相对稳定，当这些调节失去原有的相对平衡时则出现高血糖和低血糖。糖尿病、颅内压增加、脱水症等均可引起高血糖，饭后、精神紧张可出现生理性高血糖。胰岛β细胞增生或瘤癌等，垂体、肾上腺皮质、甲状腺功能减退，以及严重肝病患者均可出现低血糖症状。饥饿和剧烈运动可引起暂时的低血糖。

葡萄糖可由葡糖氧化酶氧化成葡糖酸及过氧化氢，后者在过氧化氢酶的作用下，能与苯酚及4-氨基安替比林作用产生红色醌化合物。醌的生成量与葡萄糖量成正比。

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【器材和 试剂 】

1. 器材 试管及试管架、可见光分光光度计、恒温水浴箱、微量加样器、吸量管、吸耳球、光径 1cm/>比色杯、记号笔。

2. 试剂

（1）11mmol/L的酚试剂。

（2）二合酶：主要成分为葡萄糖氧化酶（GOD 380U/ml）与过氧化物酶(POD 300U/ml)。

（3）葡萄糖标准液(100mg/dL)。

（4）磷酸缓冲液：pH7.0 ,100mmol/L。

【操作步骤】

1. 将1ml二合酶加入磷酸缓冲液，制成酶试剂。

2. 将酚试剂与等量酶试剂混合成酶酚混合液。

3. 取10ml 试管 3支，标号，按下表加入溶液：

4. 将各管分别混匀，置 37℃/> 水浴 中保温10min，然后冷至室温，以空白管校零点，以波长505nm测定标准管和测定管的吸光度值。比色杯光径 1cm/>。

5. 计算

葡萄糖含量（mmol/L）= (测定管吸光度/标准管吸光度)×100×0.0555

（注：本法对葡萄糖有专一性，不受其它糖及还原性物质干扰，其正常值为4.22～6.11 mmol/L。0.0555为换算系数。）

【注意事项】

1. 酶酚混合液和样品的用量可根据需要按比例改变，计算公式不变。

2. 缓冲液中含叠氮钠作稳定剂，不要用嘴吸，避免与皮肤接触。

3. 酚试剂有毒，切勿吞咽，如果溢出，请用大量水冲洗被污染的部位。

4. 1mL血清吸管，使用完后立即洗净，以免血清凝固在细管内。

【思考题】

1. 推导比色法定量分析中的公式。

2. 简要说明 分光光度计 的操作要领。

3. 说明临床测定血糖为何空腹采血。