电泳及转膜技术

实验概要 掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤 实验原理 1．转膜的方式：       向上的毛细管转移       向下的毛细管转移       同时向两张膜转移       电转移       真空转移 2．固相支持物的种类及选择：      硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失 DNA ， < 500 bp 的 DNA 无效，转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等）      尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的 DNA 结合容量，它能够吸附变性 DNA ，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有吸附 DNA 的功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用 10 次以上（ 10-20 次），经毛细管（毛细吸附）作用，把 DNA 从凝胶上转到膜上。 DNA 转到膜上是复制胶上的带型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定 DNA 。 3．转移缓冲液（ transfer buffer ）的选择：      带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（ SSC ），但不能充分发挥膜潜能； 0.4N NaOH ，共价结合 DNA 是最大优点。      硝酸纤维膜：高盐离子强度促进 DNA 与膜结合（ 20 × SSC ），低盐离子强度导致小片段 DNA 在转移过程中丢失， pH>9 ， DNA 不能与膜结合。 4．转膜时间（ duration of transfer ）约 12 hrs       取决于毛细管系统， DNA 大小，胶厚度 (<5 mm) 及浓度 (<1%) 。       DNA 分子量大小决定时间长短，部分去嘌呤减小 DNA ，碱转移 2hrs 大部分结合到膜。       DNA 转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过 EB 染胶，及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。 主要 试剂 0.4N NaOH 0.2NHCl 琼脂糖 主要设备 尼龙膜 滤纸 玻板 电泳槽 实验材料 酶消化好的 DNA 样品