流式CBA方法--检测大鼠细胞因子实验方案

1. 实验所需试剂

1.1 RAT IFN-GMA CBA FLEX SET （558305） 规格：100TST 组成：Rat IFN-γ 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IFN-γ PE 检测二抗试剂，Rat IFN-γ捕捉微球（定位：A6）

1.2 RAT IL-10 CBA FLEX SET （558306） 规格：100TST 组成：Rat IL-10 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-10 PE 检测二抗试剂，Rat IL-10捕捉微球（定位：A8）

1.3 RAT IL-6 CBA FLEX SET （558308） 规格：100TST 组成：Rat IL-6 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-6 PE 检测二抗试剂，Rat IL-6捕捉微球（定位：A9）

1.4 RAT TNF CBA FLEX SET （558309） 规格：100TST 组成：Rat TNF 标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat TNF PE 检测二抗试剂，Rat TNF捕捉微球（定位：C8）

1.5 Rat IL-1a Flex Set (560159) 规格：100TST 组成：Rat IL-1a标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-1a PE 检测二抗试剂，Rat IL-1a捕捉微球（定位： A4）

1.6 Rat IL-2 Flex Set (561420) 规格：100TST 组成：Rat IL-2标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-2 PE 检测二抗试剂，Rat IL-2捕捉微球（定位：Bead E5）

1.7 Rat IL-4 Flex Set (558307) 规格：100TST 组成：Rat IL-4标准品（4ml稀释TOP浓度10000pg/ml），Rat IL-4 PE 检测二抗试剂，Rat IL-4捕捉微球（定位：Bead B9）

1.8 BD Cytometric Bead Array(CBA) Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit(558266)

2. 实验操作步骤：

2.1准备Rat Soluble Protein Flex Set标准品 （Rat Soluble Protein Flex Set标准品为干粉状态，与检测试剂混合前首先应该重新稀释。）

2.1.1 打开即将用于检测对应细胞因子标准品瓶子，将所有干粉转移到15ml流式上样管中，用4ml Assay Diluent溶液稀释重悬，此管标记为TOP Standard，室温静止15min。

2.1.2 然后取9根管子，分别标记为1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128和1:256；每根管子加入500ulAssay Diluent稀释液，按照下图依次转移500ul到下一管，完成梯度稀释。

2.1.3 最后取根管标记为0pg/ml，只加入500ulAssay Diluent稀释液。

2.1.4 最终实现如下表格的浓度梯度。

2.2 混合Rat Soluble Protein Flex Set捕捉微球（捕捉微球为50倍浓度保存，使用前应稀释为最佳反应浓度）

2.2.1 按照实验要求，每种微球单次检测母液量为1ul，公式为：总体积=捕捉微球种类数*1ul*检测样本数+（捕捉微球种类数*1ul*检测样本数*49）

2.2.2 将稀释好的捕捉微球标记为“Mixed Capture Beads”待用，不能长时间储存。

2.2.3 稀释待测样本：大鼠标准品覆盖范围为40 to 10,000 pg/mL，如果预测待测样本浓度过大，需对其进行稀释。实验者根据样品预测浓度，选择合适的稀释比例，也可以使用多个稀释比例摸索一个最佳稀释量；稀释缓冲液为Assay Diluent。大鼠血清和血浆一般要求稀释4倍以上。

2.3准备大鼠Protein Flex Set检测试剂

大鼠PE检测试剂为50倍浓缩试剂，加入检测管前要确保此时检测试剂终浓度为50稀释，单次反应量为1ul。（注此过程需避光）

公式为：需要加入的Detection Reagent Diluent稀释液=反应次数*50ul-反应次数*1ul。

2.4标准品以及样品上机前处理步骤

2.4.1加入50ul大鼠Soluble Protein Flex Set Standard 稀释液到10个流式管里，