干扰素(IFN)生物学活性检测

　(一)原理 　　干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2以及人胚肌皮或肺单层细胞)产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。 　　(二)　操作步骤 　　　　　　　　96孔培养板中加入不同稀释度的IFN和标准IFN， 　　　　　　　　每个稀释度设3孔，每孔50μl，病毒对照不加IFN 　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　每孔加入100μl 1.5～2×10５／ ml Wish 　　　　　　　　　　或Hep-2细胞悬液，37℃、CO孵箱培养6～12h， 　　　　　　　　　　使细胞贴壁为单层 　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　每孔加入50μl含100个　TCID50 VSV, 　　　 　　　　 细胞对照不加病毒液 　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　根据细胞病变状态，终止培养前3～4h 　　　　　　　　　　加入5mg／ml MTT, 15μL／孔 　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　加入适量生理盐水，用滴管轻轻吹吸 　　　　　　　　　　弃去悬浮病变细胞和死细胞 　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　200μl／孔 二甲亚砜(DMSO)，作用10min 　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　　测OD(570nm),表示活细胞中含甲　的量， 　　　　　　　　　　也可用刚果红摄入法、结晶紫染色法 　　　　　　　　　　　　　测定IFN对活细胞的保护水平 　　计算: 　　以保护半数(50％)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。也可从标准曲线中求得待测样品的IFN活性单位。 　　(三)　 试剂 和器材 　　1.　VSV 　　2.　WISH、HeP-2细胞株或人胚肌皮或肺单层培养物。 　　3.　MTT[3-(4,5二甲噻唑-2-yl)-2,5-2苯基-四唑溴盐]，二甲亚砜(DMSO)，刚果红，结晶紫等。 　　4.　10％FCS RPMI1640, 培养板、 培养瓶 、CO孵箱、超净台、酶联检测仪。 　　(四)　注意事项 　　1.　实验时先加IFN，后加指示细胞，以使细胞均匀分布于培养板底部。 　　2.　本法对天然培养上清或重组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均可检测其活性单位。