免疫沉淀

免疫沉淀是利用特异性抗体识别并分离抗原的方法。 材料： 上样buffer的配方(用前现配): 2ul 1.25M Tris-HCL , pH 6.8 35ul distilled water 2.5ul 2-mercaptoethanol 12.5ul 10%SDS 10ul 80% glycerol 2ul bromphenol blue TNE buffer: 10mM Tris-HCl pH 8.0 10mM NaCl 0.5mM EDTA 方法： 1．用含有1% NP40的缓冲液重悬细胞，充分振荡。 2．在冰上孵育30分钟或37℃孵育10—15分钟 3．转入eppendorf管中离心3分钟 4．将上清轻轻倒入一干净试管，加入40—50 ul抗血清 5．冰上孵育2小时或4℃过夜 6．在TNE中加入100ul SPA 和100ul 5% BSA 7．冰上孵育2小时 8．离心使免疫复合物成球，用1ml含1%NP40,0.5% Na deoxychloate, 0.1% SDS 的TNE,在用超声波重悬 9．加入70ul的上样缓冲液，振荡。 10．热水中水浴90秒，离心1分钟，保留上清。 11．若不立即实验请低温保存。 （以上资料仅供参考） 免疫细胞化学： 1．在无菌消毒的6孔板中加入100，000个/孔细胞，过夜 2．倒掉上清，用PBS洗涤一次后立即加入-20°C的甲醇（注意不要让细胞干掉），再将板置于-20°C冰箱5分钟，然后倒掉甲醇加入PHEM 缓冲液，置于4°C。 3．加入含合适血清（2.5—5%）的PHEM 缓冲液轻微振摇一小时 4．加入一抗至封板缓冲液，轻微振摇孵育一小时 5．倒掉封板液，加入PHEM 缓冲液洗涤4次，每次10分钟 6．加入二抗至封板缓冲液，轻微振摇孵育半小时 7．倒掉封板液，加入PHEM 缓冲液洗涤4次，每次10分钟 8．用镊子夹起 coverslip，轻轻去除过多的缓冲液，加入约20ul“antifade”, 轻轻盖上coverslip, 去掉过多的”antifade” 后置于-20°C避光保存。 试剂 配方： PHEM 缓冲液：: 25 mM HEPES 10 mM EGTA 60 mM PIPES 2 mM MgCl2 pH = 6.9 （请以此顺序加入） Antifade: 1 ml 1 mg p-phenylene diamine hydrochloride 溶解在 0.1 ml 10x PBS (20 min 室温) 加入 0.9 ml 100% 甘油，封闭保存不要振摇。 若颜色变成棕色，请不要用了。分装保存在-70 °C