白细胞介素6(IL-6)生物学活性检测

㈠ 原理：IL-6在体外能促进B细胞杂交瘤的生长，故又称为杂交瘤生长因子(HGF)。小鼠B细胞杂交瘤7TD1是一株对IL-6依赖的细胞系，由Van Snick 1986年建立，只有在IL-6存在的培养基中才能生长，可以作为指示细胞来测定待检样品中IL-6水平。这类IL-6依赖的小鼠B细胞杂交瘤细胞系还有MH60·BSF2、B9等。 　　㈡ 方法：主要为３H-TdR掺入法 　　　　　　IL-6依赖的7TD1细胞用无FCS的RPMI1640洗涤2次 　　　　　　　每次1000rpm，5min，除去原培养液中的IL-6 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 用10％FCS-RPMI1640调整活细胞数2×10４/ml 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 96孔平底培养板中每孔加100μl 7TD1悬液(2×10３/孔) 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　加入不同稀释度标准IL-6和待检样品(100μl/孔) 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　37℃，5％CO２孵箱培养48～72h 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　每孔加３H-TdR 0.5μCi/50μl 　　　　　　　　　　　　　　　　↓10h 用多头细胞收集仪收获于玻璃纤维滤纸上 　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 干燥后移入液闪瓶中，加入1ml闪烁液，于液闪仪中测β射线的cpm值。 　　计算： 　　1. 根据cpm值，将能使7TD1细胞３H-TdR掺入cpm值达到最大值50％的IL-6的活性定为1u/ml。 　　2. 以刺激指数(SI)表示。 　　㈢ 试剂 和器材 　　1. IL-6依赖的7TD1细胞系 　　2. 10％FCS-RPMI1640及无FCS的RPMI1640 　　3. ３H-TdR 4. 标准IL-6 5. PPO,POPOP,二甲苯。 　　6. 9999型玻璃纤维滤纸。 　　7. 96孔平底培养板 　　8. 多头细胞收集仪 　　9. CO２孵箱 　　10. β液闪计数仪 　　㈣ 注意事项： 　　1. 7TD1细胞洗涤要充分、轻柔，每次弃洗涤上清力求彻底。 　　2. 避免 同位素 污染。 　　3. 加样品时，应从低浓度到高浓度顺序加。

　　4. 加入３H-TdR最适时机是阴性对照95％以上死亡。 　　5. 为了增加检测方法的敏感性，可采用新复苏7TD1细胞，或用pH4.0枸椽酸 缓冲液 处理培养状态的7TD1细胞。