夹心ELISA

1. 溶液准备：

包被液：50mM Na2CO3 （ pH9.6 ）， 20mMTris-HCl （ pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）

封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等

洗涤液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris盐缓冲液 （ pH7.4 ）

AKP偶联的链球菌亲和素溶液：用1×封闭液稀释酶偶联物

2. 实验程序：

1 ） 将捕获抗体包被液稀释至相应的浓度。

2 ） 在对应的孔中加入100μl抗体溶解液，室温孵育2h或4℃过夜。

3 ） 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗涤液清洗两次。

4 ） 每个孔中加300μl封闭液，孵育1h.

5 ） 倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗脱液清洗两次。

6 ） 每个孔中加100μl生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h或室温孵育3h.

7 ） 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。

8 ） 每个孔中加100μl AKP偶联的链球菌亲和素，室温孵育1h.

9 ） 倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗脱液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。

10 ） 用洗涤液浸泡5min，拍干残留液体，这一步对于减少背景信号是很重要的。

11 ） 每个孔中加满洗涤液，倒空液体并拍干残留液体，重复5次。

12 ） 每个孔中加100μl底物，显色30min并立即在405-410nm读数。