开发灵敏度高、重复性好的侧向层析诊断产品----第二部分：新方法带来的新挑战

从更多专业领域分析，适合定量诊断分析需要的新技术的开发。

侧向层析免疫诊断（LFIAs）作为一种稳定的技术适合在广泛、多样的POC或者现场使用。然而，该技术不能适用于要求非常灵敏、重复性好或者需要获得定量结果的情况。

在过去的一些年里，在制作侧向层析诊断产品方面出现了一系列新方法，使得该技术可以用于广泛、多样的更高要求的应用领域。这些革新的方法迫使对LFIAs制做原理产生新的关注，同时研究进行研究、生产所需要的资源，以便成为这个领域内成功的改革者。

本文分为两个系列篇，于六月期杂志开始登载。第一篇文章关注LFIAs行业中传统的生产技术和材料，讨论各因素造成的局限性，并且将克服这些局限性的一些方法做了概要，以便制作重复性好的诊断产品。下篇文章关注材料、信号标记试剂、读条仪和整个LFIA观念的新方向，可能开发出更定量化的，灵敏度更高的LFIA产品。伴随这些新方向而来的是一些新的行业挑战。

方向趋势 通过这些年重要的大量研发努力，已经发现了克服许多在传统侧向层析免疫诊断产品中材料和设计固有弱点的方法。使用传统的方法手段，对产品设计和生产过程做出仔细的观察，使其可能转化到生产，获得具有低水平信号变异系数（CVs）的侧向层析诊断产品。该诊断方法的灵敏度接近或优于相关竞争的技术。然而，制作具有好重复性和高灵敏度表现的LFIAs产品，可能需要在材料科学、标记技术和装置设计上作出相当大的改变。

材料科学 最初使用在LFIAs上的材料不是专为这个系统中设计的。硝酸纤维素膜、玻璃纤维、聚酯纤维、人造纤维和其他过滤介质都被调整用于这个产品，但是每种材料都表现出其固有的不均一性，在传统产品结构中影响了LFIAs的可重复性。新的材料需要比现有的材料在功能表现上有所改进。在诊断分析系统中表现出功能多样性的材料是合意的。新材料的应用为LFIA装置设计打开了全新 观念的大门。

标记物 传统使用胶体金、彩色微球或荧光乳胶干燥在标记物垫上作为微粒标记，由于其不稳定性和释放的不均一导致高的差异水平。由于生产扩大上的缺陷和由检测手段的局限性导致的信号丢失，这些标记物的灵敏度往往是有一定的局限性。在对三维空间材料（例如NC膜）的视觉检测中，仅仅能检测到大约膜表面10um深度的信号；在该系统中剩余的信号被丢失。

新标记物，与具有选择性的材料连接并且配有读条系统，能产生重大的性能改进，可做为已经在用的标记物的替代物。

装置设计和读条仪，装置设计革新保留了传统LFIA合意的部分，但尝试避免由于主要材料和制做过程产生的缺陷。许多的这类设计依靠读条仪配合。因此，他们需要多学科交叉研发，增加了产品的设计和研发周期的复杂性。

材料和装置设计 对于使用在侧向层析诊断产品中具有多重功能的叠层吸水材料，可能引入智能特性的东西，使制造过程更加复杂，同时增加了诊断产品的变化性。下一代侧向层析诊断产品要达到高重复性和高灵敏度的要求，需要关注开发使用在该类诊断产品中的新材料。这适合于整个诊断装置，而不仅仅是对于膜系统。

虽然在过去十年中做了一些革新的尝试，真正应用于LFIA材料的新方法，独特的反应表面和标记物垫材料，并不是很多。这些对于某些部分进行的尝试并不能满足市场需求。然而最近出现在市场上的几个革新似乎显示出一些被接受的情况。

考虑LFIAs材料选择时，设计者可能关注以下多种表现特性：

• 高度规则表面介质带来了优质线条品质

• 拥有一致膜孔径大小、厚度和蛋白结合能力的三维结构材料

• 在多种吸水速率下的正确毛细层析

• 在有可能情况下最轻薄化

• 在整个产品保质期保持好的流体流动特性，独立测试

• 在整个产品保质期保持毛细时间增加的低CVs值，独立测试

• 最小程度的金属污染

• 低荧光背景干扰

图1、 图示快速诊断研究， 使用Fusion 5的HCG诊断产品。Whatman (Florham Park, NJ)。(a) 0 秒， (b) 15 秒， (c) 1 分钟。

• 无干扰反应

• 储藏期间的稳定性

• 非易燃性

• 低成本

• 共价联结的活性

• 多功能性，例如，单一材料作为标记垫、样品垫、反应载体、分离介质和吸水介质。

几种新材料和相关的设计方向是在这些基本原则下进行研发的，虽然仍未有能完全实现所有列出描述的产品进入市场。下列一些产品就是说明。

革新的材料，一种符合上述一些描述的材料被研发，这就是Whatman(Florh am Park, NJ)公司的Fusion 5材料。该大孔径、单层材料是亲水的和本来就不能被蛋白结合的。这种材料意义在于单一材料实现了用于传统侧向层析装置上所有材料的功能。它可以作为样品垫、胶体金垫、膜和吸水纸。

由于它不能被蛋白结合，Fusion 5不适合传统的将测试线和控制线喷点到介质层的使用方法。一种策略被作为代替办法，有点象在流水中放一个大石头。大直径珠粒（大约2um）被标记到测试线和控制线蛋白上，然后被喷点到材料的适当位置。大珠粒被固定在材料中，并形成测试线和控制线区域。当样本和标记抗体结合复合物层析通过所谓的“大石头”时，在这个区域出现了蛋白结合和信号表现。

该系统固有的开放孔径意味着检测能被极其快速的完成，表现出阴性和阳性结果。速度或者反应时间对于LFIAs是重要的，但在多数情况下它与灵敏度构成反相关。在Fusion5中使用珠粒方法极大地克服了这个问题，且拥有低背景值和增

图2 微柱结构的4CastChip，Amic AB (Uppsala, Sweden)产品。

加了配体结合的表面积。

将Fusion 5应用于LFIA产品，能使生产过程变得非常简单。LFIAs标准生

产中的基本步骤，浸泡、干燥和层叠，都被省略。使用该材料必需满足一个要求，相关的大颗粒在测试线和控制线区域内能沉积形成线条，这可能是技术难点。然而，该沉积过程通过使用非接触和接触两种方式喷点，被证明具有技术可行性。

微柱层面 另一种新的分析和材料设计方向是Amic AB (Uppsala, Sweden)的4CastChip.该公司研发出一种诊断分析层面，其在塑料表面分布有高度规则的微柱阵列（见图2）。

图3 Amic装置流道的规则柱结构

图4 肌钙蛋白I（TnI）数据，反应发生在Amic 4CastChip上。用 Molecular Devices Corp. (Sunnyvale, CA) 的GenePix扫描仪获得量化数据

4CastChip中的微柱表面被右旋糖苷修饰为亲水性的，且驱动流道内的样品和试剂毛细层析。同样，微柱为测试线和控制线处的捕获配体提供了一个生物适应性好的表面。该材料与标准的NC膜材料相比具有高度规则性（见图3）。象Fusion 5一样，Amic公司的装置提供了多种功能，微柱构成的流道能作为加样区、反应表面和吸水垫。

在芯片表面上，将蛋白结合到该材料的表面是通过氨基和醛基间的共价吸附力。蛋白被喷点到表面，然后在潮湿环境中，短时间内发生联接反应。该材料能应用于发生高灵敏反应的分析产品，其使用荧光标记，且与读条系统连接时能测出明确的灵敏度值（见图4）。

在芯片表面上，将蛋白结合到该材料的表面是通过氨基和醛基间的共价吸附力。蛋白被喷点到表面，然后在潮湿环境中，短时间内发生联接反应。该材料能应用于发生高灵敏反应的分析产品，其使用荧光标记，且与读条系统连接时能测出明确的灵敏度值（见图4）。

与Fusion 5一样，在生产期间，该装置有可能减少生产流程中的一些步骤。同时，它需要将蛋白连续喷点到离散的材料表面，该工作仅能通过非接触喷点技术来完成。芯片要求单片生产操作，从生产过程的观点来看可能是一个弱点，反之象NC膜类的材料可以实现滚轴式的生产。喷点方式必须具有高度的规则性、

重复性和精细控制，以便确保线宽度是一致的（见图5）。

4CastChip表现出LFIA层构思路上的转变，作为一种有效的两维空间层构，不是由离散的孔构成的。然而，该装置表现出真实的毛细能力，有极其规则的亲水表面和产生视觉上可接受的灵敏度线条（在系统测试时间内，与已知的应用于临床和POC系统产品中的材料相比）。该材料自身具有高度稳定性和能保持蛋白长期结合在稳定的位置上。所以，它符合在本文开头列出的理想装置的很多标准。

图5 BioDot公司(Irvine, CA) 的AD 3200型喷涂仪。