生物药和生物仿制药三维构像的指纹化分析

云桥生物技术公司最近开发的蛋白质构象矩阵ELISA技术(PCA-ELISA)能从分子水平上系统、灵敏并且快速的分析蛋白质药物的三维构象。最近美国的医疗保健法为仿制药的审批和商业化指明了道路，届时将引起目前已上市的主要的生物药间的激烈竞争。如何保持生物仿制药与原创药的高度相似是目前生物制药产业所面临的巨大挑战，而争论的焦点集中在“仿制药与原创药到底多相似才可以称为足够相似。”2011年8月，FDA在新英格兰医学杂志的热点透视和在2012年2月发行的指导性文件中概括了仿制药审批所面临的挑战，并指出希望用“类似指纹分析的方法”来比较原创药与仿制药的相似性，以此推动仿制药的开发，加速仿制药的批准。本文将介绍一种“类似指纹分析的”专用于单克隆抗体三维构像相似性的酶联测定方法。 在过去的三十几年里，生物药物，特别是蛋白质药物在医药总销售额中的比重逐渐增大，2010年大约占药物销售总额的1/3。今后十几年，很多原创药专利到期将影响它们的销售额，不论是传统药还是专利药制造商都会加速生产仿制药和生物改良药。经过系统而全面的分析，与原创药高度相似的药物被称为生物仿制药。依据美国生物制品价格竞争和创新（BPCI）法案（2009年）仿制药的审批流程将大大缩短。生物改良药一般要优于原创药，但作为新的分子实体更需要经过严格而完整的审批程序。下文将重点讨论生物仿制药与原创药的相似性分析。 与小分子药物不同，生物药的生产过程十分复杂，这就意味着仿制药永远不可能与原创药在分子水平上完全相同。即使仿制药与原创药采用相同的基因，由于克隆载体、表达系统、发酵和纯化过程的差异都会导致仿制药与原创药产生非相似性。FDA和仿制药制造商所面对的问题是“仿制药与原创药到底应该多相似才可以得到批准和投放市场？”。 虽然美国生物制品价格竞争和创新法案阐述了仿制药的审批流程，但是还有一些问题尚待解决，包括建立能够客观评价仿制药与原创药相似性的质量标准。2012年2月，FDA的指导性文件进一步建议可以采用“一种类似指纹分析的方法”全面对比原创药与仿制药的相似性，这将有助于加速仿制药的审批 (lines 312-319, FDA Draft Guidance “Quality Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Protein Product”, Feb 2012) ，并能为仿制药的研发与生产提供重要的生物学信息，以确保仿制药的安全性和有效性。 利用PCA-ELISA技术绘制原创药物的“指纹图谱”   云桥生物技术公司的研究人员经过不断的探索，发现生物药物（蛋白质药物）抗原表位的三维分布（surface epitope distribution）可作为分析药物分子三维构象变化的敏感指标。进一步研究发现，若能发明一种方便灵敏的类似指纹分析的技术，则可以为生物仿制药与原创药物相似性比较提供一种有效的工具。基于这样的考虑，我们开发了一系列的蛋白构象矩阵ELISA（PCA-ELISA）试剂盒，以检测生物仿制药与原创药物三维结构的相似性。该试剂盒可提供生物药物三维结构及均一性的准确信息，可应用于生物仿制药/原创药物研发的各个阶段，包括细胞株的筛选、药物开发、配方研究及产品质量控制等。该试剂盒是根据原创药物的全部氨基酸序列设计多肽抗原并制备相应的多肽抗体，然后用多肽抗体包被96孔平板，利用ELISA法可检测原创药物的全部表面抗原的分布。在正确折叠的药物分子中，只有少数抗原表位暴露于药物分子表面，当药物分子的高级结构发生不同成度的改变时，原本被掩盖的抗原表位暴露出来，导致某些多肽抗体对其抗原的识别信号增强。该试剂盒通过建立针对药物分子所有抗原表位的抗体矩阵技术，有效的绘制出原创药物三维构象的“指纹”图谱，从而检测药物分子结构的差异。该方法对于蛋白分子的结构改变或变性极为敏感，可检测出低至0.1%的蛋白样品新的表面抗原点的出现或消失。 此试剂盒利用成熟的夹心ELISA分析方法进行检测，除酶标仪和多通道移液器外并不需要特殊的实验设备。每个检测试剂盒提供包被了30或31个多克隆抗体的96孔板，平板中的每一列孔包被一种多克隆抗体，共六个位置。每个试剂盒可检测一个仿制药（三次重复），或同时检测两个仿制药与原创药的相似性（两次重复）。 高级结构改变的早期预测？   我们提供了通过ELISA测定的7种商品化单克隆抗体药物的Fc段（恒定区）的构象分析结果。实验结果显示这7种生物技术药物恒定区的构象各不相同，但是不同单克隆抗体的恒定区具有几乎相同的氨基酸序列，这表明不同单克隆抗体的基因整合位置，细胞株的不同，生长和纯化条件的不同等都会影响单克隆抗体的三维构像。还有三种在临床期间失败的单克隆抗体候选药物恒定区的构象分析结果，比较可以发现，在这三种候选药物中有两种药物在Ab17和Ab18的对应位置（接近铰链区）原本被掩盖的抗原表位暴露出来，而另外一种药物则是在Ab23和Ab24的对应位置（接近糖基化位点）暴露了被掩盖的抗原表位。虽然我们并不知道新暴露出来的抗原表位是否导致这些药物在临床实验中失败，但是它们之间的关系值得进一步的探究。 结论   由于生物技术药物及生物技术仿制药物具有显著的治疗优势及快速的经济增长势头，其开发必将逐年增加。FDA提出，指纹样分析技术将有助于提高生物技术药物的开发效率、改善其安全性，而PCA-ELISA作为一种专利技术恰好能够实现这一目标。目前研发的试剂盒主要针对当前市场上最常用的7种单克隆抗体药物（利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、阿达木单抗、西妥昔单抗、阿伦单抗、帕利珠单抗，和一个原创药物（新型分子）的三维构象检测。每个试剂盒利用PCA-ELISA技术，可分析一个仿制药与一个原创药三维构像的相似性（三次重复），也可同时对两个仿制药与一个原创药的相似性进行比较（两次重复）。测定时，顾客只需要提供待检测的生物仿制药物和待比较的原创药物，云桥生物可为用户提供检测试剂盒或直接进行检测服务。