不同浓度竟争模板和控制混合液的配制
EP管号 竟争模板gGM浓度 (ng/μl)用量110.0 10μl21.010μl30.810μl40.610μl50.410μl 60.210μl70.11
| EP管号 | 竟争模板gGM浓度 (ng/μl) | 用量 |
| 1 | 10.0 | 10μl |
| 2 | 1.0 | 10μl |
| 3 | 0.8 | 10μl |
| 4 | 0.6 | 10μl |
| 5 | 0.4 | 10μl |
| 6 | 0.2 | 10μl |
| 7 | 0.1 | 10μl |
| 8 | 0.08 | 10μl |
| 9 | 0.06 | 10μl |
| 10 | 0.04 | 10μl |
| 11 | 0.02 | 10μl |
| 12 | 0.01 | 10μl |
| 13 | 0.001 | 10μl |
（1）不同浓度的竞争模板和控制混合液的配制，(每管体积均为10μl)；
（2） 标准混合液的制备：GM―CSF上游引物(5nmol/ml)48μl，GM―CSF下游引物48μl，dNTP贮备液(2.5mmol/L 每种浓度)96μl，(GM―CSF cDNA(0.6μg/μl 12μl)，1 0×PCR缓冲液120μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl)1.2μl，双蒸水756μl；
（3） 向竞争模板GM-cSF 1#～11#管中加入90μl上述混合液；
（4） PCR进行40个循环,参数为94℃ 1min，62℃ 1min,72℃ 2min；
（5） 取反应液各20μl，一式三份，在2.5％琼脂糖凝胶中电泳分析；
（6） 测定每管中(gGM)和cGM的含量,以密度计对电泳胶片进行分析测定；
（7） GM―CSF/GM―CSF cDNA对已知竞争GM―CSF量的函数作图。在比例为1:1的等值点处cGM=gGM。据此，可判断未知cDNA的浓度。
基因组GM-CSF与cDNA扩增后的比率与加入反应中原始基因组DNA的关系（图中显示0.1-1.0ng的范围）
相关文章
