H33342释放法检测单核-巨噬细胞胞毒作用

H33342 释放法检测单核-巨噬细胞胞毒作用   【基本原理】  H33342（Hoechst33342）为DNA的特异性荧光染料，可用其标记肿瘤细胞以检测单核细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。被损伤的靶细胞DNA断裂后，H33342释放到上清液中，采用微量荧光仪可定量测定上清液中的荧光强度。效应细胞的杀伤活性与靶细胞释放的荧光强度呈正相关。该方法同样可用于CTL、NK、LAK或TIL等杀伤细胞的活性检测。   【试剂及材料】 （1）         靶细胞（L929细胞株，对单核细胞的杀伤活性敏感） （2）         H33342 （3）         微量荧光"W"测量板（德国Dynatech公司产品） （4）         用自动微量荧光分析仪（Micro-FluoDynatech）   【操作方法】 （1）         从单个核细胞中采用粘附法分离的单核细胞，经非特异性酯酶（ANAE）和台盼蓝染色，细胞纯度应>90％，细胞活力应>95％； （2）         收获靶细胞并将细胞浓度调至1×107 /ml； （3）         加入终浓度为10μmol/L的H33342，置37℃标记2h； （4）         用DMEM液离心洗涤3次，重悬浮于完全DMEM培养液中； （5）         将效应细胞和标记的靶细胞按一定比例（一般为20-50∶1）加入96孔圆底培养板200μl/孔，作3个复孔；置37℃5％CO2 温箱培养20h； （6）         离心后从每孔取150μl上清液，分别加至微量荧光"W"测量板； （7）         用自动微量荧光分析仪（Micro-FluoDynatech）测定3孔的OD值，求得平均值。激发波长为360nm，发射波长450nm。每次试验同时作下列对照:自发释放值:测定单独培养的靶细胞上清液荧光强度。最大释放值:测定靶细胞用1％Triton X-100裂解后的荧光强度。   【结果分析】 　　　　                               实验组OD值-自然释放组OD值 　　　　单核细胞杀伤活性（％）= ─────────────── ×100％        　　　　　                    最大释放组OD值-自然释放组OD值