PCR常见问题及处置

PCR 常见问题及处置       1、没有扩增产物形成：     ①循环温度，特别是解链温度是否确切，注意PCR仪的指示温度是否与实际温度相符；     ②引物的组成是否正确，有无二级结构的形成；     ③聚合酶活性是否正常；     ④反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物降解，可在95℃以上处理反应系统使其灭活；     ⑤某些来源的DNA可能有较难去除的蛋白质成分,抑制PCR系统,用蛋白酶K重新处理即可。       2、非特异性产物的出现:     ①提高退火温度,缩短退火或延伸时间；     ②调整引物，Taq DNA聚合酶或模板；     ③调整Mg2+用量；     ④减少热循环次数。       3、引物二聚体的形成:     ①检查引物的序列，特别是在3端是否有互补区；     ②提高退火温度；     ③调整引物与模板浓度，使模板比例增高；     ④增加引物长度；     ⑤减少热循环次数。       4 、预防假阳性结果：设置一系列对照，如     ①阳性对照：应用已知阳性模板；     ②阴性或空白对照：加无关或不加模板DNA；     ③重复试验：重要的实验结果要反复验证，下结论要慎重。