PCR-SSP扩增体系的组成和准备

PCR-SSP 扩增体系的组成和准备   （一）SSP引物混合液的准备 预先准备好所有引物的混合液，其中包括除Taq多聚酶和待测基因组DNA之外的所有PCR反应成分，即： （1） 2pmol 5’ 末端和3’末端的引物 （2） 2pmol 内参照引物（β-actin基因引物） （3） 200umol 各种d-NTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP） （4） 1 X PCR缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01%明胶。     （5） Ficoll 400 （终浓度为1%，V/V） （6） 加样缓冲液（甲酚红，终浓度为0.001%，W/V） 上述引物混合液准备好后，分装至作好标记的PCR扩增管中，每扩增管中上述引物混合液的体积为36ul，反应体积的调整使用双蒸水，不要使用TE，EDTA 可抑制Taq多聚酶的活性。置于-20C保存，临用时取出。 （二）DNA/Taq多聚酶混合液的准备 （1）         计算扩增所需管数，每对SSP引物须用一只扩增管单独扩增； （2）         计算Taq多聚酶用量，每扩增管需Taq多聚酶0.5～0.8U； （3）         计算基因组DNA总量，每扩增管需60ng的基因组DNA； （4）         将基因组DNA和Taq多聚酶在一定量的稀释液中混匀，即为DNA/Taq多聚酶混合液，稀释液为上述1 X PCR缓冲液（注意 ：每扩增管所需的基因组DNA和Taq多聚酶的量应包括在4ul体积的DNA/Taq多聚酶混合液中）； （5）         用加样器将基因组DNA与Taq多聚酶混匀，注意混匀时避免形成气泡，否则容易导致气溶胶状DNA的形成，造成污染。 （三）PCR-SSP扩增体系的组成 （1）         取出装有SSP引物混合液的扩增管，加入4ul的DNA/Taq多聚酶混合液，注意用加样器将DNA/Taq多聚酶混合液加入至引物混合液的底部，每扩增管的反应体积为40ul（注意 ：基因组DNA应完全稀释和混匀，吸取或接触不同扩增管的液体后，注意更换吸头；使用的吸头最好带滤膜）； （2）         每个扩增管加20ul矿物油，防止PCR扩增时水分蒸发。   PCR-SSP 扩增 按下述扩增条件进行PCR扩增〔适合Perkin-Elmer9600或PTC1000（MJ Research Inc）PCR扩增仪，其他型号的PCR扩增仪也可以参考上述扩增条件〕 94℃预变性         5分钟 94℃变性           20秒 65℃退火和延伸     60秒 循环次数           30次