编码15肽随机DNA片段的克隆

编码 15 肽随机 DNA 片段的克隆       (1)M13KE载体的大量酶切     双酶切反应 体系：     M13KE载体(1ug)        2 ul     H2 O                   32 ul     10XNE Buffer 3         4 ul     EagI(10 U／ul)          1 ul     Acc65 1(10 U／ul)       1 ul     (共40 ul)     37℃孵育3h后，电泳纯化回收后，通过p―Agarase降解所含琼脂糖。       (2)酶切载体与合成片段的连接：为确保连接效率的最大化，同时采用不同的反应体系进行预连接，在每20ul的反应体系中，按照表进行反应，然后在16C连接过夜。   反应体系 ┌─────┬─────────────────┐ │          │    3：  l    5  ：  l    10：  l │ ├─────┼─────────────────┤ │    40 ng │     200UT4    200UT4    200U T4  │ │    100 ng│     200UT4    200UT4    200U T4  │ └─────┴─────────────────┘       (3)电转化感受态菌的制备：在LB平板上划线接种ER2738菌株，37C培养16h。从LB平板上挑选单个菌落接种于1m1LB培养液中，37C、150r／min培养16h。取200ul菌液接种于10m1的LB培养液(含20％葡萄糖)，37C、250r／min培养至A600=0．7～0．8(约3～4h)，冰浴10min，4℃、5 000r／man离心10man，弃上清液，并倒扣在吸水纸上1man，加入5nd的10％预冷甘油重悬细菌沉淀。4℃、5 000r／man离心10man，弃上清液，并倒扣在吸水纸上1man，加入2心的10％预冷甘油重悬细菌分装100ul／Ep，-70℃保存。       (4)电转化：取1ul连接产物与100ul预冷的感受态细菌加入至0．2mm电穿孔杯中进行电转化。电转化仪使用参数：脉冲电压为2 500V，电容为25uF，并行电阻为200Ω。     次日对每个板上的克隆数目进行计数，选择克隆数/ug最高的连接方案进行连接。     正式转化时首先将连接产物通过酚／氯仿抽提的方法进行纯化，然后为了避免一个细菌克隆中转入超过一个的DNA克隆，将一个转化反应分散到尽量多的转化体系中进行。