常用的活性微珠及活化微珠的交联
常用的活性微珠，活化微珠的交联
| 交联机制 | 蛋白质上的结合基团 | 最终交联的稳定性 | 推荐基质 | 商品举例 |
| 羰基二咪唑 | -NH2 | 避免pH>10 | 琼脂糖珠 交联琼脂糖珠 聚丙烯酰胺 | CM Bio-Gel A Gel(Bio-Rad) ECH Sepharose 4B(Pharmacia) Reacti-Gel 6X(Pierce Chemical) Reacti-Gel GF-2000(Pierce Chemical) |
| 溴化氰 | -NH2 | 好，某些能溶解 | 琼脂糖珠 | CNBr-activated Sepharose(Pharmacia) |
| 羟基琥珀酰亚胺 | -NH2 | 非常好 | 交联琼脂糖珠 聚丙烯酰胺 | Affigel 10(Bio-Rad) HiTrap NHS-Activated(Pharmacia) Affigel 10(Bio-Rad) |
| 碘乙酰 | -SH2 | 非常好 | 交联琼脂糖珠 聚丙烯酰胺 | SulfoLink(Pierce Chemical) UltraLink Iodoacetyl(Pierce Chemical) |
| 氯化Tresyl | -NH2 -SH2 | 非常好 | 交联琼脂糖珠 | Affinica Tresyl(Schleicher & Schuell) Tresyl activated agarose (Pierce Chemical) |
抗体与固相基质共价结合的另一种常用方法是利用多种化学试剂使微珠活化，然后将纯化的抗体与活化的微珠结合。这种方法有许多优点。通常可以在超越蛋白质能够耐受的苛刻条件下使微珠活化，因此可以采用很多激活方法。此外，这类方法形成的交联，在范围广泛的变性条件下仍保持稳定。另一个优点是活性微珠有商品出售，表2-4列举5种常用的活性微珠及其生产厂家。 【准备工作】 应用抗体亲和层析柱对各种蛋白质进行纯化时，关键是在尽量温和的条件下将抗原从层析柱上洗脱，才能保持蛋白质的结构和／或功能不发生变化。洗脱的难易程度取决于抗原与抗体之间结合键的类型和数量。在制备层析柱用于大规模纯化之前，有必要对所有可利用的抗体进行测试，从中选择适当的抗体制备亲和层析柱。 *所用的抗体溶液中不应含有无关的化合物，因其可通过反应基团结合到活性微珠上，注意结合反应是发生在抗体的氨基或巯基上。如果在抗体制备和纯化时使用了含有这些基团的化合物，必需用0.5M PBS(pH7.5)缓冲液充分透析。 【试剂和特殊设备】 (1)纯化的抗体 (2)0.5mmol/L磷酸钠(pH7.5) (3)含1mol/L NaCl的0.05mol/L磷酸钠溶液(pH7.5) (4)100mmol/L乙醇胺（pH7.5） (5)摇床 【操作步骤】 (1)用0.5mol/L,pH7.5的磷酸钠溶液将抗体配成所需浓度。留少量样品供测定交联效率用。每次实验用于交联的抗体量可能不同，通常每毫升微珠加10mg抗体可得到纯化效果较好的层析柱。 (2)加入按产品使用说明制备的活化的微珠 (3)置摇床上轻轻混合放室温过夜。 (4)用0.5mol/L磷酸钠(pH7.5)洗涤微珠2次。留取结合过夜的上清，比较交联前、后样本中的蛋白含量。 (5)用含1mol/L NaCl的0.05mol/L磷酸钠溶液（PBS,pH7.5)洗涤微珠l次。 (6)加10倍体积的100mmol/L乙醇胺（pH7.5)在室温下孵育4h或过夜，振荡。 (7)用PBS洗涤2次，加入0.01%硫柳汞，免疫微珠可置4贮存，数月内保持稳定。 制备好的微珠即可用于抗原的免疫亲和层析
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