佛波酯和钙离子载体诱导的CTL颗粒酶释放分析法

佛波酯（phorbol esters）和钙离子载体诱导的CTL颗粒酶释放分析法   【基本原理】    用佛波酯（phorbol esters）和钙离子载体处理CTL，通过一种TCR复合物非依赖性机制，刺激CTL细胞颗粒酶的胞泌作用。   【试剂及材料】 （1）         1mg/ml十四酰佛波乙酸酯（phorbol myristate acetate，PMA）二甲亚砜溶液。 （2）         1mg/ml钙离子载体A23187的二甲亚砜溶液。配制上述两种试剂的时应注意其毒性和致癌性。   【操作方法】 （1）         用完全RPMI-1640培养液分别稀释上述两种溶液，使PMA为40ng/ml和钙离子载体溶液为为2μg/ml； （2）         取无菌96孔细胞培养板，每孔加入2×106 /ml CTL悬液50μl，然后加入25μl 40ng/ml PMA和25μl 2μg/ml 的钙离子载体溶液（两液的最终浓度PMA为 10ng/ml和钙离子载体为0.5μg/ml）并设颗粒酶总释放对照孔（50μl CTL+40μl完全培养液+10μl 1％Triton X-100）和背景孔（50μl CTL+50μl完全培养液），各孔最终体积为100μl；均设三复孔； （3）         将培养板置5％CO2 温箱，37℃温育4h； （4）         收集培养上清液按TCR单抗诱导法测定和计算酶分泌量。