固定和包埋的组织标本DNA PCR反应模板的制备

固定和包埋的组织标本DNA PCR反应模板的制备       石蜡包埋组织和其他固定组织代表档案标本。由于PCR可以扩增相对于完整的染色体DNA来说较短的DNA片段，而且在一定程度上可接受降解的DNA，所以固定组织适用于分子遗传学研究。这些组织是前瞻和回顾性分子遗传学和感染疾病研究的巨大资源。大部分固定和包埋组织标本经福尔马林固定，分析前样品大多要进行脱蜡和水化，再用蛋白酶消化。    【试剂与配制】 （1）辛烷或二甲苯 （2）丙酮 （3）无水乙醇 （4）消化缓冲液：50mmol/L Tris-Cl(pH8.5)， 1mmol/LEDTA， 0.5%Tween20，20mg/ml蛋白酶K    【操作方法】 方法一：由石蜡块制备DNA 1．  脱蜡：组织切片一般5～10μm厚。用同一切片机切不同标本时，应注意标本间的交叉污染。应在两次操作间用二甲苯认真搽洗刀片、镊子和任何可能污染的部位。 每片切片用一小镊子夹入微量离心管中，按下法进行脱蜡。 （1）   加1ml辛烷或二甲苯于微量离心管中，盖紧盖后室温作用30min； （2）   12，000rpm离心5min，沉淀组织和残存的石蜡； （3）   小心吸去壁上残存的辛烷，保存太久和较脆的组织在第一步后就会破碎，应小心操作以防组织丢失； （4）   重复（1）～（3）步； （5）   加入0.5ml无水乙醇，反转混匀，同（2）离心，小心吸去乙醇； （6）   重复（5）一次，尽可能除去壁上残存的乙醇，乙醇漂洗的目的是除去辛烷； （7）   真空干燥只至乙醇完全挥发。干燥样品时，用封口膜封住离心管，并在其上打几个小孔，目的是防止样品间的交叉污染和来自真空瓶的污染。干燥后，小心处理去掉封口膜，此时，封口膜已被标本污染。若无真空干燥装置，可向每管中加入3滴丙酮，不盖盖，小心置于37～50℃水浴以促进丙酮挥发，这样也可除去残存的乙醇。 2．  蛋白酶K消化 （1）   向上述干燥样品中加入100μl消化缓冲液，若组织较多，则加200μl消化缓冲液； （2）   55℃保温3hr或37℃过夜； （3）   短暂离心，使盖上和壁上蒸发冷凝的水份沉至管底； （4）   95℃，8～10min灭活蛋白酶K； （5）   离心后分装上清（每份1～10μl），-20℃保存。 方法二：由细胞载玻片上制备DNA （1）在二甲苯中浸泡2天以移走盖玻片； （2）在浓度递减的乙醇溶液中（100%，70%，30%）持续温育以去除H&E染色，彻底除去染色是成功扩增所必需的； （3）加入蛋白酶K缓冲液使细胞从载玻片上脱落，小心地将细胞刮至1.5ml离心管中； （4）50℃消化样品60hr； （5）消化完毕后，将蛋白酶K灭活，直接扩增样品。有些时候需将DNA进一步纯化（苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀）。    【注意事项】 （1）固定石蜡包埋材料作以PCR为基础的研究成功与否取决于几个因素：①组织制作过程中使用的固定剂；②固定持续的时间；③石蜡块保存的时间；④需扩增的DNA片段的长度。研究表明，乙醇和含乙醇类固定剂对核酸PCR的影响小于其他固定剂。这可能是由于甲醛和含汞固定剂使核酸与蛋白质间发生交联，而乙醇则没有这种作用。由于组织固定剂的种类和固定时间影响PCR扩增的结果，因此，在用保存标本作回顾性调查前，应慎重参考文献报道的每种标本处理法，充分了解待处理标本的固定方法、固定时间和固定剂的优劣。这有利于对扩增结果进行解释； （2）对PCR结果影响较大的固定剂固定的标本和长时间固定的标本的扩增要选择扩增短的序列； （3）在上述操作的混匀步骤中，不要用涡旋混悬器混匀，以免机械剪切力造成DNA片段的断裂。