抗人肺腺癌单链抗体的构建

抗人肺腺癌单链抗体的构建       (1)将表达载体pFUW80质粒经XbaI和EcoRI双酶切，同样双酶切在pUC19中克隆的VL基因，分别回收后，连接并转化大肠杆菌JM109株，鉴定阳性重组子(可通过XbaI、EcoRI双酶切切下合适大小的带，即VL片段)。     (2)将上述经过鉴定的重组质粒用XhoI、SpeI双酶切，回收后，与同样双酶切的在pUC19中克隆的VH基因相连，再次转化JM109感受态细菌。重组质粒筛选、鉴定同上所述。至此抗人肺腺癌单链抗体构建完成。随后分别转化不同的表达菌株进行附着型或外分泌型表达研究。 在构建单链抗体时，亦可设计一组通用引物，可用于扩增小鼠大多单克隆抗体的V区基因。在VH3’（或VL3’）端和VL5’（VH5’）端的引物中合成含有连接序列(linker)，采用RT-PCR的方法先分别扩增VH和VL基因，再进行重叠延伸PCR扩增含VH-linker-VL或VL-linker-VH基因，然后克隆到原核表达载体中进行表达。     常用的PCR引物序列如下(供参考)： 1）   VH5’端引物 5’-GTGCAGTCGAC CA（AG）CT（GT）GTG（CG）AGTC（AT）GG-3’ 2）   VH3’端引物 5’-ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTG(AC)(AG)-GAGAC(AG)TGTGAGCGTGG-3‘ 3）   VL5’端引物 5’-GGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGACATTGTGATGACCCAGTCTCCA-3’ 4)VL3’端引物 5’-GCAGTCTAGA ATTATTTTAT(CT)TCCAGCTTGGTCCC-3’ 【注意事项】 1．构建ScFv时可分别扩增VH和VL,并分别将其克隆至表达载体的Linker两端。如采用重叠延伸PCR方法扩增VH和VL基因，可直接将其克隆到原核表达载体中。 2．现多采用RT-PCR的方法克隆VH和VL基因。 3．引物设计：根据免疫球蛋白家族最好设计一组引物，以便能扩增出大多数单抗的VH和VL基因。 4．如为了进一步构建融合蛋白，在设计引物时均不应加终止密码。