抗体库的构建

抗体库的构建       【材料和试剂】     （1）电转仪 （2）电击杯 （3）SB培养基 （4）SOC培养基 SB培养基经高压灭菌后，降温至60℃或60℃以下，加入20ml经过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液。  50mg/ml氨苄青霉素水溶液，过滤除菌。  10mg/ml 卡那霉素水溶液，过滤除菌。  4% PEG溶液     【操作步骤】     （1）将第4步得到的连接物与300μl感受态细菌混匀旋转1min,转移到电穿孔小槽中电脉冲穿孔。     （2）电穿孔时的参数可选择2.5kV,0.2cm电击杯,25μFD和200欧姆(BioRad公司的Electroparation Pulser)或用BioRad公司的E.coli Pulser转化。立即冲洗电击杯,先用1ml,然后用2ml室温SOC冲洗细菌,立即于37℃振荡培养(250r/min)1h。     （3）加入10ml 37℃预热的SB(含20μg/ml氨苄青霉素,Amp),立即涂布平板,做100μl,10μl,1μl三种涂布;     （4）其余培养物于37℃振荡培养(以下均为300r/min)1h,补加Amp至终浓度为50μg/ml,再于37℃培养1h。     （5）将培养物全部转接于100ml含50μg/ml Amp的SB中,37℃过夜培养。     （5a）制备质粒DNA,插入另一条链的可变区基因。通常先构建轻链库,再构建重链库；回到步骤（1）将第二条链插入已构建的第一链的库中。插入第二条链后,进行步骤（6）,省略步骤（5）和（5a）。     （6）加入辅助噬菌体M13K07 1012pfu;将培养物转入100ml SB(含50μg/ml Amp),37℃振荡培养2h。     （7）加入卡那霉素至70μg/ml,30℃或37℃振荡培养过夜。     （8）4000r/min离心细菌,4℃ 15min,将上清转移至一个干净的无菌瓶中,加入4％PEG 8,000和3％NaCl,用摇床振荡5min以使其溶解。     （9）冰浴沉淀噬菌体30min。     （10）9000r/min离心(4℃)20min弃上清。在纸巾上吸干10min,尽可能除去PEG。     （11）用2ml TBS/1％ BSA重悬,转移入5ml离心管中,14,000r/min离心5min,取上清贮存4℃(长期保存应加入0.02％NaN3)。只有新鲜制备的噬菌体可以用下面的筛选,因为残存的蛋白酶很容易将ScFv从噬菌体表面切下。长期贮存的制备物应重新感染扩增再用于筛选。     （12）从离心的细菌中制备噬菌粒DNA,贮存。