快速裂解酵母细胞制备样本（蛋白质的电泳分离）

快速裂解酵母细胞制备样本（蛋白质的电泳分离）       使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。   【试剂与设备】 （1）待检测的酵母菌 （2）25%三氯乙酸（TCA） （3）1%SDS （4）丙酮 （5）RIPA缓冲液：          50mmol/L  Tris•HCl  (PH7.5)          150mmol/L  NaCl          1%   Nonidet  P-40 (NP-40)          0.5% 去氧胆酸钠          0.1%  SDS （6）玻璃珠（直径0.45～0.50mm） （7）台式离心机 （8）水浴箱 （9）涡漩振荡器 （10）加样器与吸头等   【操作步骤】 （1）0℃以12 000g离心1min，从1ml培养物中收集细胞，废弃上清液（当靶细胞为分泌型蛋白时除外）； （2）用0.5ml 25%三氯乙酸（TCA）重悬细胞； （3）按步骤1离心回收细胞，重悬于1ml 90%丙酮中； （4）按步骤（1）离心，估算沉淀物体积，加入等体积1%SDS重新悬浮沉淀物； （5）加入经酸处理的玻璃珠（直径0.45～0.50mm）至溶液的弯月面处； （6）振荡悬液5次，每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷却1min，在相差显微镜下监测细胞裂解情况； （7）用一烧红的皮下注射器针头（23号）在微量离心管的顶盖上穿一小洞，以防加热过程中玻璃球冲出离心管； （8）在沸水浴中加热3min； （9）把玻璃珠转移到另一个微量离心管中，用0.5ml RIPA缓冲液洗涤原离心管，并把洗液合并于内装玻璃的管中； （10）在微量离心管底部打一小洞，回收细胞提取液，这一操作使用烧红的皮下注射器针头效果最佳。把仍装载玻璃球的微量离心管置于另一空微量离心管上，把如此重叠的一对微量离心管，于4℃以2000g离心2min； （11）回收下面一只内有细胞提取液的微量离心管，于4℃以2000g离心5min，使提取液澄清，移出上清液置于另一个微量离心管中，-20℃贮存备用。   【注意事项】      酵母细胞提取液储存于-20℃一般是稳定的，但是，如果待测蛋白被水解，则应在提取液中加入蛋白酶抑制剂，并保存于0℃。