HRP标记抗体的方法

酶与抗体交联的方法有许多种 , 根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备 HRP 结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

　　戊二醛二步法 　　 1. 　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶 - 戊二醛 - 免疫球蛋白结合物。 　　 2. 　标记步骤： 　　 (1) 　称取 HRP25mg 溶于 1.25 ％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 　　 (2) 　反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在 1ml ／ 1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于 5ml ，则以 PEG 浓缩至 5ml 。放置 25ml 小烧杯中，缓慢搅拌。 　　 (3) 　将待标记的抗体 12.5mg 用生理盐水稀释至 5ml ，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 　　 (4) 　用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25ml ，继续搅拌 3? 小时。 　　 (5) 　加 0.2M 赖氨酸 0.25ml ，混匀后，置室温 2 小时。 　　 (6) 　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置 4 ℃ 1 小时。 　　 (7) 　 3000rpm 离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4 的 PBS 中。 　　 (8) 　将上述溶液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析，去除铵离子后 ( 用萘氏试剂检测 ) ， 10,000rpm 离心 30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 　　 3. 　结果判定： 　　 (1) 　定性及效价滴定：用特异性抗原 ( 或抗体 ) 同酶标记抗体 ( 或抗免疫球蛋白抗体 ) 作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接 ELISA 法 ( 或在正式实验系统里 ) 对酶结合物进行滴定 ( 见本节 ( 三 ) 工作浓度的选择 ) 。 　　 (2) 　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定 ( 光程 1cm) 。 　　酶量 (mg ／ ml) ＝ OD403nm × 0.4 　　 IgG 量 (mg ／ ml) ＝ OD280nm-OD403nm × 0.42) × 0.94 × 0.62 　　　　　　　　　酶量 (mg ／ ml) 　　 IgG 量 (mg ／ ml) 　　酶量 　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4 　　　　　　　　　　 40,000 　　　　　　 160,000 　　　 IgG 量 　　　 (3) 　本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有 2 ～ 4 ％的酶与蛋白质结合。 　　 4. 　试剂及器材： 　　 (1) 　 0.1M PH6.8 磷酸缓冲盐水 (PBS) ：取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml ， NaCl1.8 克，加蒸馏水至 200ml 。 　　 (2) 　 1.25 ％戊二醛液：取 25 ％戊二醛 50ml 与 PH6.8 的 PBS1ml 混合。 　　 (3) 　 1M PH9.5 碳酸盐缓冲液：取 1M 碳酸钠 3ml 与 1M 碳酸氢钠 7ml 混合。 　　 (4) 　 0.2M 赖氨酸溶液：称赖氨酸 29.2mg 溶于 0.01M PH9.5 碳酸缓冲液 1ml 中。 　　 (5) 　 0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。 　　 (6) 　 PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 　　 (7) 　萘氏试剂及聚乙二醇 (PEG ， MW2000) 。 　　 (8) 　纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。 　　 (9) 　 HRP(RZ>3.0) 。 　　 (10) Sephadex G-25 层析柱 (2cm × 50cm) 。 　　 (11) 搅拌器，分光光度计，离心机。 　　 (12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。 　 　　简易过碘酸钠法 　　本法是以 NaIO ４先将 HRP 表面的糖分子氧化成醛基，然后再与 Ig 上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近 70 ％的 HRP 和 Ig 结合， 99 ％的 Ig 与酶结合，酶与 Ig 的活性无重大损失，是目前最常用的方法。 　　 1. 　原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭 HRP 上残留的α - 和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wilson 等改用在低 PH 下使 NaIO ４氧化 HRP ，从而省去了二硝基氟苯封闭 HRP 步骤。 HRP 经 NaIO ４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用 NaBH ４ ( 或乙醇胺 ) 还原生成稳定的酶标记抗体。 　　 2. 　标记步骤 : 　　 (1) 　称取 5mgHRP 溶解于 1ml 蒸馏水中。 　　 (2) 　于上液中加入 0.2ml 新配的 0.1M NaIO ４溶液，室温下避光搅拌 20 分钟。 　　 (3) 　将上述溶液装入透析袋中，对 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4 ℃过夜。 　　 (4) 　加 20 μ l 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化� RP 的 PH 升高到 9.0 ～ 9.5 ，然后立即加入 10mg IgG( 抗体，或 SPA5mg) 在 1ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌 2 小时。 　　 (5) 　加 0.1ml 新配的 4mg ／ ml NaBH ４液，混匀，再置 4 ℃ 2 小时。 　　 (6) 　将上述液装入透析袋中，对 0.15M PH7.4 PBS 透析， 4 ℃过夜。 　　其余步骤 ( 纯化 ) 同戊二醛标记步骤的 (6) 、 (7) 、 (8) 。 　　 3. 　结果判定： 　　除标记物 IgG 量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。 　　 IgG 量 (mg ／ ml) ＝ (OD280nm-OD403nm × 0.3) × 0.62 　　 4. 　试剂及器材 : 　　 (1) 　 0.1M NaIO ４：称取 241mg 高碘酸钠 ( 广州化学试剂厂，批号 830602) 溶于蒸馏水 10ml 中。 　　 (2) 　 1mM PH4.4 醋酸钠缓冲液 : 　　 0.2M NaAc (1.361 克／ 50ml) 3.7ml 　　 0.2M HAc (0.601ml ／ 50ml) 6.3ml 　　加蒸馏水至 2,000ml 。 　　 (3) 　 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液 : 　　　　　　　 Na ２ CO ３ 0.32 克 　　　　　　　 NaHCO ３ 0.586 克 　　　　　　　加蒸馏水至 50ml 　　再用蒸馏水作 20 倍稀释，即成 0.01M PH9.5 的碳酸盐缓冲液。 　　 (4) 　 NaBH ４溶液 (4mg ／ ml): 　　临用时称取