浓缩MHC-I单体折叠反应物

浓缩MHC-I单体折叠反应物   上述折叠的HLA-I/抗原肽复合物存在于1L的折叠缓冲液中，需要进行浓缩，可以采用超滤进行浓缩。 【试剂及设备】 试剂与材料：20mM Tris(PH8.0)             Biomax 30 membrane 设备：      超滤装置（Amicon 500ml  Stir  Cell）             带有压力调节器的氮气瓶 【操作步骤】 （1）按照操作程序连接好超滤装置，将500ml待浓缩的样品（折叠反应物）加入超滤装置中，将压力调节至60psi，进行常规超滤浓缩。 （2）重复一次，将另500ml折叠反应物进行超滤浓缩。 （3）最后将上述折叠反应物超滤浓缩到约7ml的体积。 （四）缓冲液平衡     上述步骤制备的单体HLA-I类分子需要进行缓冲液平衡，可以采用下述二种方法之一。 方法一：透析 【试剂及材料】 1.            材料 （1）透析袋（Spectrapor 7）和夹子 （2）1升的烧杯 （3）1 X PBS （4）100mM  PMSF （5）7ml浓缩后的折叠复合物 2.            试剂：生物素化缓冲液：         100mM    Tris(PH7.5)         200mM    NaCl         5mM      MgCl 【操作步骤】 （1）将1升生物素化缓冲液加入1升的烧杯中，并放一个磁力搅拌棒于其中。冷却至4℃。 （2）准备透析袋，10ml浓缩物用二倍容积的透析袋进行透析，以便在透析时体积扩大。 （3）用合适大小的夹子将透析袋的一端夹住，小心地将浓缩后的样品吸入透析袋，夹住另一端，并留出可供体积扩大的空间。 （4）将透析袋置于上述烧杯中，并将烧杯放在磁力搅拌器上，在4 ℃进行透析。 （5）以中/低速旋转2-3小时，或直到透析袋中的沉淀溶解。 （6）小心地吸出透析袋中的样品，并将其分装于离心管中（1.5ml/管）。 （7）在低温台式离心机中以最大速度离心，以除去沉淀。   方法二：用脱盐柱进行缓冲液交换     PD-10交换柱是为蛋白质溶液进行缓冲液交换而设计的，其中的微珠孔径（6000MW）比绝大部分蛋白质要小，但比缓冲液中其他分子要大。当蛋白质溶液流经该柱时，蛋白质分子很快通过，而其他分子被截留在柱子的微珠中。因此，流出的蛋白质是溶解在平衡柱子的缓冲液中，从而实现了蛋白质的缓冲液交换。 【试剂及材料】 1、   材料： PD-10 脱盐柱（Amersham Pharmacia，PD-10） 2、   试剂：生物素化缓冲液             100mM    Tris(PH7.5)             200mM    NaCl             5mM      MgCl2 【操作步骤】 （1）按照操作程序将柱子准备好。 （2）用25ml生物素化缓冲液平衡柱子，该柱子的容量大约是5ml，加入5ml缓冲液，待其流出后，再加入5ml，共平衡5次。 （3）加入2.5ml样品。最初流出的2.5ml液体应弃去。 （4）当这2.5ml样品完全进入柱子后，在柱底部用15ml收集管开始收集流出的液体。 （5）加3.5ml上述缓冲液，让其完全流进柱子，收集样品。每个柱子收集3.5ml流出液，样品中的蛋白都会收集在流出中。 （6）为了柱子能够再次使用，先用10ml 去离子水洗柱子，然后用25ml 20%乙醇或PBS+0.1%叠氮钠冲洗。