腺相关病毒载体介导的基因转移

腺相关病毒载体介导的基因转移     腺相关病毒(adeno―associated virus，AAV)是一种单链DNA病毒，属微小病毒科依赖性病毒属。通常情况下，AAV感染细胞后可以原病毒的形式整合到宿主细胞染色体上，随细胞染色体一起复制；当有辅助病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒等)存在时，AAV基因组可被拯救出来，即产生有感染活性的AAV。20世纪80年代，AAV全基因组的克隆为AAV分子生物学研究以及AAV载体构建奠定了基础。迄今腺病毒相关病毒已发现9个血清型，根据其抗体交叉反应的不同分为AAVl―9，其中AAV2、3、5型为人类易感，AAV2目前在基因治疗研究和临床试验中应用较多。     AAV的基因结构相对较简单，由一条长约4．7kb的单链DNA构成，其中间是两个开放阅读框(ORF)，分别编码衣壳蛋白(Cap)和与病毒复制有关的蛋白质(Rep)，两侧是与病毒复制起始和终止相关的反向重复序列(1TR)，包含了复制、包装、拯救及整合信号。野生型AAV2的基因组仅含4 681个核苷酸，两端有一由145个核苷酸组成的ITR，中间还包含了rep和cap两组基因。基因治疗用AAV载体仅包含了两端的ITR序列，剔除了rep和cap两组基因，并以治疗基因所取代。AAV是迄今为止所发现的唯一与人类疾病无任何相关性的病毒，野生型AAV能特异性整合于人类”号染色体的长臂中，因而AAV是目前基因治疗中最为理想、最具应用前景的病毒载体之一。AAV作为基因治疗的载体具有宿主范围广、可以感染非分裂期细胞、稳定性好、不干扰外源基因的表达、免疫原性弱、重复注射不会引发免疫反应等优点。但也有包装容量有限(最大不得超过5．2 kb)、难以大量制备、包装效率较低等不足。     重组AAV对活体肌肉、脑和肝细胞的感染效率较高，但从感染到开始表达外源基因需要的时间较长，一旦开始表达，可维持较长时间。有报道带有LacZ基因的腺相关病毒载体肌内注射后，在肌纤维中p―gal阳性可持续两年。脑细胞及视网膜内注射也获得了类似的结果，说明腺相关病毒载体可能非常适合在活体条件下将基因转入特定的靶细胞。1999年，美国宾州大学High和Mark与美国Avigen公司合作，开展了腺相关病毒途径的血友病B基因治疗临床试验，获得了安全和有效的结果。     尽管AAV是一种较理想的基因治疗载体，但在基因治疗临床试验中的应用仍然较少，仅40项，其主要原因在制备方面。传统的AAV制备方法采用双质粒共转染―腺病毒辅助包装法，不仅操作繁杂，而且产生的重组病毒滴度低，不适合大规模生产。近年来人们在包装细胞系和辅助病毒上进行了改良，以期提高病毒载体的制备效率。病毒基因工程国家重点实验室吴小兵博士等发展了一种新型的重组AAV载体包装系统，突破了常规的双质粒共转染法的技术局限。另外发现，氯化铯密度梯度离心分离纯化AAV病毒对病毒活性的影响很大，通常要损失50％，所以人们又开始探索其他能够有效替代氯化铯的分离介质，如碘海醇(iodixan01)或采取高效液相层析(HPLC)、肝素固相亲和层析等。     由于AAV病毒载体的独特优点，相信腺相关病毒载体将会在遗传病等疾病的基因治疗中发挥重要的作用。