环氧合酶的免疫印迹法及操作

摘要目的］以环氧合酶2为例，具体介绍本实验室常用的免疫印迹法，并明确实验操作中应注重的细节。［方法］总蛋白抽提及定量、SDSPAGE、半干转印、特异性抗体结合及ECL检测。［结果］采用本法操作简便，有很好的重复性，本实验室多次成功运用于COX2蛋白的检测。［结论］此法在本实验室多次运用，可靠、重复性强，明细实验操作细节更有利于初学者顺利地开展实验，值得应用与推广。

关键词环氧合酶免疫印迹法免疫印操作

EstablishmentofImmunoblottinginDetectingCOXProteinandItsManipulation

LiangYi，FangJianqiao

ShanghaiUniversityofTCM（201203）

Abstract：［Objective］Tointroduceamodifiedmethodforimmunoblottingindetectingproteinandtoshowallthedetailsneedingtobepaidattentionto。WetakeCOX2forexample。［Method］Totalproteinswereextractedandquantified。DenaturedproteinswereseparatedbySDSPAGEandweretransferredsemidrylytoNCmembrane，thenthelatterwasboundwithspecificantibody。Finally，proteinexpressionwasdetectedbyECL。［Result］Themethodwasconciseandeasytomanipulate。ThemethodhadbeensuccessfullyusedtodetectCOX2proteininourlabandthepictureswerereproducible。［Conclusion］Everystepofthemethodisdescribedindetail。Itishelpfulfornovicetocarryoutimmunoblotting。Thisestablishedmethodisworthytoberecommended。

Keywords：cyclooxygenase;immunoblotting;operation

免疫印迹又称蛋白质印迹，是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的借助特异性抗体鉴定抗原的一种免疫生化技术。由于SDSPAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，该法已被广泛用于蛋白质表达的检测。环氧合酶2是一种诱导酶，一般极少表达，在受到各种刺激时表达迅速上调，其高表达与炎症疼痛、肿瘤的发生发展密切相关。本实验室建立了一种简单实用、成功率高的免疫印迹，以检测COX2蛋白表达为例，说明实验操作的具体步骤和应注重的细节。

1材料

11试剂与配制30%丙烯酰胺溶液、单去污裂解液［1］［50mMTris，150mMNaCl，002%NaN3，100＆mu;g/mlPMSF，1＆mu;g/mlAprotinin，1%Triton］、2＆times;SDSPAGE样品缓冲液［008MTrisHCl，2%SDS，5%＆beta;ME，10%甘油，溴酚蓝01mg］、SDSPAGE电泳缓冲液［25mMTris，250mM甘氨酸，01%SDS］、考马斯亮蓝染色液、脱色液、转印缓冲液、1＆times;TBST缓冲液、封闭液、10＆times;丽春红S染色液。低分子量标准蛋白质、NC膜、BCA100蛋白定量试剂盒、兔抗鼠COX2多抗、HRP标记山羊抗兔IgG、EZECL试剂盒、X线胶片。

12样本取材经福氏完全佐剂致炎24h后的Wistar大鼠炎症足爪组织。

13主要仪器设备半干电转移槽、垂直电泳槽、电泳仪及紫外分光光度计、ZD9556水平摇床。

2方法

21总蛋白提取取样本约100mg，液氮中研成粉末，收集入Eppendorf管后，加入1ml单去污裂解液和10ulPMSF，于冰浴中静置30min后，12000rpm低温离心20min，取上清液分装，－70℃保存。

22蛋白定量采用BCA法，严格按试剂盒要求进行操作。

23SDSPAGE

23。1聚丙烯酰胺凝胶配制根据分子克隆实验指南配方［1］，分别配制10%分离胶溶液和5%浓缩胶溶液，室温静置聚合。

232样品变性在浓缩胶聚合期间，变性样品，即取适量蛋白样品加等量2＆times;SDSPAGE样品缓冲液，100℃变性3min，稍适离心以待上样。

233SDSPAGE上样，并在未加样的孔中加等体积1＆times;SDSPAGE样品缓冲液［2］。电泳参数：先加压80V至溴酚蓝进入分离胶，调压至150V，至溴酚蓝达胶底。

24半干转印取出电泳完毕的凝胶，切除多余部分，将其与NC膜、滤纸置转印缓冲液浸泡15min，按厚滤纸、NC膜、凝胶、厚滤纸的顺序排列，逐层赶气泡，组装好凝胶膜三明治，放入半干转印槽中，转印参数：恒流10mA/cm2，90min。

25染色将转印好的NC膜置于1＆times;丽春红S染液中染5min，双蒸水脱色后观察NC膜上的蛋白条带。转印完毕的凝胶置于考马斯亮蓝染液中室温染色05h，其后用脱色液脱色3－4h，其间更换脱色液4次以上。根据丽春红S染色后的Marker条带，剪取含66KD样品条带的NC膜。

26封闭与特异性抗体结合NC膜在封闭液中室温封闭1h，再用1＆times;TBST缓冲液室温搅动洗膜3次，15min/次，分别用稀释好兔抗鼠COX2多克隆抗体（1∶1000），4℃孵育过夜。随后室温搅动洗膜4次，15min/次，加入RP标记山羊抗兔IgG（1∶5000），室温搅动孵育2h，其后再次室温搅动洗膜3h，其间换液6次以上。

27ECL检测在暗室中进行。将ECL发光试剂A液和B液等量混匀，室温静置5min，将孵育好的NC膜置于发光试剂中，室温反应1min，将膜沥干，置保鲜膜上，将保鲜膜另一半覆盖在NC膜上，迅速将X线胶片置于其上，压紧，曝光1min，随后将X线胶片常规显影、定影，晾干胶片存档备用。

3结果

本法根据BCA法蛋白定量后，分别以每泳道30、20和10＆mu;g的量上样。电泳结束后，我们将同期电泳另一块凝胶用考马斯亮蓝染色，作为转印前的蛋白条带对照，结果显示变性蛋白在凝胶中得到很好分离，且在664KD四周有含量较多的蛋白条带。图2所示为转印后凝胶染色结果，与图1相比，凝胶上没有明显的蛋白条带，说明凝胶上的蛋白条带已转印出胶。通过丽春红S染色，进一步确定出胶的蛋白已转印在NC膜上且未见气泡，并根据Marker条带剪取含目的分子量大小的NC膜块。通过以上3张图的对比观察，我们推断凝胶上的蛋白条带已经较完全地转印至NC膜，可以进行后续的检测工作。图4结果显示COX2蛋白在炎症组织中呈明显高表达，其表达量与上样量成正相关。

Lane1：30ug;Lane2：20ug;Lane3：10ug

图1转印前凝胶考马斯亮蓝染色图（略）

图2转印后凝胶考马斯亮蓝染色图（略）

图3NC膜丽春红S染色图（略）

图4WesternBlotting法检测大鼠痰症足爪COX2蛋白表达图（略）

4讨论

环氧合酶是炎症介质前列腺素E2合成过程中的一个重要限速酶，目前认为环氧合酶在炎症的发生、发展过程中发挥重要作用［5］。目前认为COX存在2个异构体：稳定表达型COX1和可诱导型COX2［3］。COX1为组成酶，存在大多数组织和各种细胞中，合成PGs来调节细胞的正常生理活动，对外来刺激其表达变化较小；而诱导酶COX2，在未受炎症、细胞因子等刺激的细胞不易检测到，在受到细菌脂多糖、炎症细胞因子等刺激时诱发性高表达［4］。因此，我们采用福氏完全佐剂致炎24h后的组织检测COX2蛋白的表达，结果也显示：在致炎后24h的足爪组织中，COX2蛋白呈高表达。在免疫印迹的操作过程中，有许多值得注重的细节：①蛋白提取过程中应注重减弱蛋白酶作用，常用手段为低温操作和加蛋白酶抑制剂［5］。确保所提取的总蛋白中含有目的蛋白是本实验的关键。②SDSPAGE过程中要避免内槽缓冲液渗漏和电泳产热过高等问题，同时在凝胶制作过程中如出现室温偏低凝胶聚合缓慢，则可将其置于37℃恒温箱或加大TEMED和APS的用量以加速聚合；分离胶灌注后建议用异丁醇覆盖以免氧气扩散抑制聚合。③转印过程切记将NC膜置阳极、驱逐转印块中气泡。将凝胶连同NC膜紧靠最左边第一泳道左下角切一小角以标识凝胶方位，是实验中的小窍门。④抗体孵育一定注重抗体种属衔接。抗体稀释度过低及其随后洗膜不彻底都是导致曝光背景过高的主要原因。我们实验中采用培养皿加保鲜膜的方式，有效节约了一抗的用量。⑤ECL检测中最重要的一点：确保NC膜蛋白面，正对X线胶片，此时在转印过程中剪的标识角极为管用。同时胶片表面划痕、覆盖保鲜膜产生的气泡和皱褶都会影响胶片条带曝光效果，都应予以避免。此外，我们体会转印条件恒流和恒压都是可取的，立春红染色使转印在NC膜上的蛋白条带可视化，观察蛋白条带是否转印完全、有无气泡，并结合转印后凝胶的染色结果观察，推断转印的效率，便于实验者做出是否继续实验的决定。本文只是举例说明了免疫印迹法的具体步骤及应注重细节，具体的蛋白提取方法和聚丙烯酰胺凝胶的浓度要根据蛋白的性质和分子量来决定。该法我们已经重复多次应用于COX蛋白的检测［6］，也成功检测了I＆kappa;B＆alpha;蛋白表达，成功率高，便于初学者学习和把握该技术，因此认为该方法值得推广。

参考文献 ［1］J。萨姆布鲁克，E。F。弗里奇，T。曼尼阿蒂斯［M］。分子克隆实验指南。北京：科学出版社，1999：753，883。

［2］汪家政，范明。蛋白质技术手册［M］。北京：科学出版社，2000：80。

［3］方剑乔，邵晓梅，梁宜，等。电针治疗CIA大鼠慢性炎症及对COX2的选择性抑制作用［J］。浙江中医药大学学报，2006，20（3）：169173。

［4］方剑乔。环氧合酶2在炎症疼痛中的表达及电针干预的可能性［J］。浙江中医学院学报，2002，26（2）：5153。

［5］E。哈洛，D。莱恩。抗体技术实验指南［M］。北京：科学出版社，2002：136。

［6］方剑乔，梁宜，邵晓梅，等。电针对角叉菜胶致炎大鼠的治疗作用和COX蛋白表达的影响［J］。针刺研究，2006，30（4）：225229。