单链抗体的构建

单链抗体的构建     【材料和试剂】    （1）杂交瘤细胞株。    （2）大肠杆菌菌株JM109，此菌含有LacIq、LacZ、M15，可进行α-互补试验检测重组子。    （3）克隆质粒pUC19及表达载体质粒pFUW80(有关pFUW80的性质、特点及物理图谱，详见本章其他部分)。    （4）引物。    （5）主要试剂：包括杂交瘤培养、RNA提取、PCR扩增所用试剂及cDNA合成试剂盒。    【操作步骤】    1．寡聚核苷酸引物的设计和合成  根据Ig可变区基因的序列特点，以及已发表的小鼠VH和VL基因序列，设计若干套分别对应于不同亚类Ig骨架区序列FR1和FR4的通用引物。为了便于克隆和表达，在引物两端引进合适的酶切位点。其中VH5’端引物为XhoI识别序列，VH3’端引物为SpeⅠ识别序列；VL 5’端引物为XbaⅠ，3’端引物为EcoRⅠ。利用不同的5’端和3’端引物组合进行相同的PCR扩增抗小细胞肺癌单抗的VH和VL基因，发现如下一套引物扩增效果最好；扩增产物琼脂糖凝胶电泳带均一，且无杂带。其序列如下：     VH5’端引物(XhoⅠ)： 5’-GGCTCGAGGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTGCC-3’     VH3’端引物(SpeⅠ)： 5’-GGACTAGTTGCAGAGACAGTGACCGGAGTCC-3’     VL5’端引物(XbaⅠ)： 5’-CCTCTAGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCC-3’     VL3’端引物(EcoRⅠ)：5’-CCGAATTCTTTTATTTCCAGCTTGGTGCCTC-3’    2．PCR反应扩增VH和VL 从鼠杂交瘤细胞株WLA-2C4中提取基因组DNA作为PCR反应的模板，加入引物和其他试剂。进行PCR反应。反应液总体积为100μ1，加样如下：  5’端引物                          0.5μl(约0.2μg)  3’端引物                          0.5μl(约0.2μg)  2mmol/L dNTP                      10μl  10×PCR 缓冲液                    10μl  基因组DNA                         5μl(约0.2μg)  ddH2O                             74μl  液体石蜡                          75μl100℃变性10min后，加入Taq DNA聚合酶0.5μl(5u/μl)，进行PCR循环。VH：94℃ 60s，65℃ 60s，72℃ 60s；VL：94℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 90s。各进行30个循环。    3、目的基因克隆  VH和VL扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳回收后，以引物两侧的酶进行双酶切：即VH用XhoI和SpeI双酶切；VL用XbaI和EcoRI双酶切，产生具有粘性末端的酶切扩增产物。分别与经同样双酶切的pUC19质粒连接，转化JM109菌。由于pUC19质粒含有Amp和LacZ基因片段，转化入JM109菌中会产生α-互补作用；在含IPTG和X-Gal的LB平板上生长时会产生蓝色菌落；插入了目的基因(VH或VL)的重组子会导致pUC19 LacZ基因片段的失活，从而形成白色菌落。对白色菌落重组子进行双酶切鉴定。VH重组子经XhoI、SpeI双酶切，VL重组子经XbaI、EcoRI双酶切，观察是否有所需大小的带，即VH和VL扩增产物被切下。    4．目的基因测序  取上述经蓝、白菌落筛选，双酶切鉴定正确的重组子，以双脱氧链终止法测序。