免疫共沉淀技术

免疫共沉淀技术     当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的蛋白质―蛋白质间的结合被保持下来，因此可用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质―蛋白质相互作用。如果实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用，第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测；如果实验目的是发现新的结合蛋白，可以直接对胶上蛋白质进行染色来确定。其实验步骤如下。     (1)用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。     (2)将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4~C以最大速度离心15min。     (3)收集上清液(约30mi)并加入30ug的适当抗体，4~C摇动免疫沉淀物1h。     (4)加入0．9ml的蛋白质A―Sepharose悬液，4~C摇动免疫沉淀物30min。     (5)用含900mmol／LNaCl的NETN洗蛋白A―Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗1次。     (6)吸出混合物的液体部分。加入800／Jl的1XSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。     (7)将样品加入到大孔的不连续SDS―PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。     (8)如果实验目的是发现新的结合蛋白，通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。对于实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用，第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测。     (9)如果实验目的是发现新的结合蛋白，从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1m1 50％乙腈洗两次，每次3min。     (10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABl 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。