IHC 常用试剂配方集锦：其他

 一、缓冲液　　免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。　　1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）　　试剂： NaH2PO4·2H2O　　Na2HPO4·12H2O　　配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。　　（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。　　（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：称取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或 Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。　　 （3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温 保存即可。　　2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS）　　试剂：0.2mol/L PB　　　50ml　　NaCl 　　　　　　　　　8.5～9g(约0.15mol/L)　　重蒸水 　　　　　　　　至1000ml　　配制方法：称取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。若拟配制0.02mol/L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推。　　PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之 间，否则需要调整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB的pH。　　3．Karasson –Schwlt’s磷酸盐缓冲液　　试剂： NaH2PO4·H2O　　3.31g　　Na2HPO4·7H2O　　　　　33.77g　　重蒸水 　　　　　　　　至1000ml　　配制方法：同前　　该缓冲液主要用于配制Zamboni’s固定液。　　4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。　　试剂：Tris(三羟甲基氨基甲烷)　　60.57g　　1N HCl　　　　　　　　　　　　　约420ml　　重蒸水 　　　　　　　　　　　　至1000ml　　配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至 1000ml。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，用时取储备液稀释10倍即可。　　该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS）、DAB显色液。　　5．Tris缓冲生理盐水（Tris Buffered,Saline,TBS）　　试剂：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液　　　100ml　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　　3.5～9g(0.15mol/L)　　重蒸水　　　　　　　　　　　　　　至1000ml　　配制：先以重蒸水少许溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。　　TBS主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。　　6．Tris-TBS(PBS)　　试剂：Triton X-100　　　　　　　10ml(1%)或3ml(0.3%)　　0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.6）　　1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)　　NaCl　　　　　　　　　　　　　　8.5～9g　　重蒸水　　　　　　　　　　　　　至1000ml　　配制方法：先以重蒸水少许溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris缓冲液或（PB），最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。　　该液常用浓度为1%及0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。　　7．0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸缓冲液　　试剂：0.2mol/L二甲胂酸钠　　　　　　500ml　　0.1N HCl　　　　　　　　　　　　　　28ml　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　至1000ml　　配制方法：先称取二甲胂酸钠（MW：214）42.8g,加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液；再取HCl 1.7ml加蒸馏水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。　　8．几种常用的不同pH值缓冲液的配制表　　（1）0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0）pH0.2mol/L NaH2PO4(ml)0.2mol/L Na2HPO4(ml)5.793.56.55.892.08.05.990.010.06.087.712.36.185.015.06.281.518.56.377.522.56.473.526.56.568.531.56.662.537.56.756.543.56.851.049.06.945.055.07.039.061.07.133.067.07.228.072.07.323.067.07.419.081.07.516.084.07.613.087.07.710.589.57.88.591.57.97.093.08.05.394.7　　(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.19～9.10）pH0.2mol/L Tris(ml)0.2mol/L HCl(ml)H2O7.1910.018.012.07.3610.017.013.07.5410.016.014.07.6610.014.015.07.7710.014.016.07.8710.013.017.07.9610.012.018.08.0510.011.019.08.1410.010.020.08.2310.09.021.08.3210.08.022.08.4110.07.023.08.5110.06.024.08.6210.05.025.08.7410.04.026.08.9210.03.027.09.1010.02.028.0　　(3)0.2mol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6～5.6）pH0.2mol/L醋酸（ml）0.2mol/L醋酸钠（ml）3.646.33.73.844.06.04.041.09.04.236.813.24.430.519.54.625.524.54.820.030.05.014.835.25.210.539.55.48.841.25.64.845.2　　(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4）pH0.2mol/L二甲胂酸钠（ml）0.2N HCl(ml)蒸馏水5.02523.551.55.22522.552.55.42521.553.55.62519.655.55.82517.457.56.02514.860.36.22511.963.16.4259.265.86.6256.768.36.8254.770.37.0253.271.87.2252.172.97.4251.473.6　　注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。　　（5）0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7）pH0.2mol/L Na2CO3(ml)0.2mol/L NaHCO3(ml)9.24.046.09.37.542.59.49.540.59.513.037.09.616.034.09.719.530.59.822.028.09.925.025.010.027.522.510.130.020.010.233.017.010.335.514.510.438.511.510.540.59.510.642.57.510.745.05.0　　三、显色液　　免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：　　1．DAB（Diaminobenzidine）显色液　　DAB即3，3-二氨基苯联胺　　试剂：DAB（常用四盐酸盐）　50mg　　0.05mol/L TB 　　　　　　　100ml　　30% H2O2　　　　　　　　　30～40μl　　配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。　　DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于 电镜观察。

但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB 有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。　　2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）显色液　　配方1：4-Cl-1-萘酚 　　　　　　　　100mg　　纯乙醇　　　　　　　　　　　　　　 10ml　　0.05mol/L TB(pH7.6)　　　　　　　　190ml　　30% H2O2　　　　　　　　　　　　 10μl(0.003%)　　配制方法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。　　配方2：4-Cl-1-萘酚　　N-二甲基甲酰胺（DMF）　　0.05mol/L TB(pH7.6)　　30% H2O2　　配制方法：先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮 状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀）。显色时间通常为5min左右。　　4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。　　多数认为最好去除白色沉淀（如上述），但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。　　3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）显色液　　试剂：AEC　　　　　　　　　　　20mg　　二甲基甲酰胺（DMF）　　　　　　2.5ml　　0.05mol/L醋酸缓冲液（pH5.5）　　50ml　　30%H2O2　　　　　　　　　　　　25ml　　配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入30%H2O2。切片显色时间为5～20min。　　该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。　　4．TMB显色液　　试剂：TMB　　HCl　　亚硝基铁氰化钾　　无水酒精　　配制方法：　　（1）醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。　　（2）A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。　　（3）B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。　　（4）孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充分混合。（液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染）。酶反应时，加入终浓度为0.005%的H2O2。　　（5）主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS）中漂洗数次（每次约10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用 20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml）继续孵育液20min左右（19℃～23℃），捞出标本漂洗数次（共30min左右）。

在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴 片、脱水，封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5）中负染5min后贴片、脱水、封片。　　TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性， 使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。

同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部 位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故 TMB反应的检测阈较低。

由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A 液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。　　5．NBT显色液　　试剂A液：5%NBT：称 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）内，充分混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温。　　B液：5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，用前恢复至室温。　　C．显色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管内，充分混匀；再加入B液40μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。　　NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚- 磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。　　四、粘附剂　　在免疫细胞化学工作中，由于标本（如切片）的脱落常影响工作的质量的速度，故粘附剂的选择和使用就显得较为重要。　　1．铬矾明胶液　　试剂：铬矾　　　　　　　　0.5g　　明胶（Gelatine）　　　　　5g　　H2O　　　　　　　　　　 ~1000ml　　方法：在1000ml的烧杯或烧瓶中，以500～800ml H2O加温溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾。注意温度过高易使明胶烧糊，包被玻片时最好控制水温在70℃。如有明显残渣，过滤后使用。　　2．甲醛-明胶液　　试剂：40%甲醛　　　　　　2.5ml　　明胶　　　　　　　　　　0.5g　　蒸馏水　　　　　　　　　至100ml　　配制方法：用少许蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml混匀即可。　　3．多聚赖氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）　　试剂：多聚赖氧酸　　　　　 5g　　蒸馏水　　　　　　　　　　 ~1000ml　　配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4℃保存，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。　　4．Vectabond试剂　　该试剂是Vector公司新进推出的一种新型玻片粘附剂。该试剂与一般的粘附剂不同，它是通过对玻璃表面起化学修饰作 用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮 配）。处理载玻片前（事先酸处理），用染色缸装好各种液体，按下列程序进行：　　干净载玻片→丙酮5min→Vectabond试剂工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：将载玻片用镊子夹住浸入Vectabond试剂1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃过夜）→用铝箔包好，室温存放备用。　　注意：避免污染（尘埃等）。　　综上述方法处理的载片一般可存放半年以上。　　五、封固剂

　　1．甘油-TBS及甘油-PBS

　　配制方法：按比例将甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4℃，冰箱静止；待气泡排除后方可使用。

　　2．甘油-明胶（冻）　　试剂：明胶　　　　 10g　　甘油 　　　　　　　12ml　　蒸馏水　　　　　　 100ml　　香草酚　　　　　　 少许　　配制方法：称取1g明胶于温热（约40℃）的蒸馏水中，充分溶解后过滤，再加入12ml甘油混合均匀。少许香草酚是为了防腐。　　3．液体石蜡　　液体石蜡因含杂质少，很少引起非特异性荧光，故常用于荧光组化及免疫荧光法时标本的封固。　　4．DPX　　试剂：Distrene 　　　10g　　酸二丁　　　　　　　 5ml　　二甲苯　　　　　　　35ml

DPX 为中性封固剂，用于多种染色方法匀不易褪色，但组织收缩较明显，故应尽量使其为均匀的一薄层。DPX现有商品出售，可直接应用。若感过于粘稠，也可加少量 二甲苯稀释后应用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯挥发后，片子上出现许多干燥的空泡，影响观察，遇有这种情况，可用二甲苯浸泡掉盖玻后重新封固。

　　六、酶消化液　　1．0.1%胰蛋白酶　　试剂：胰蛋白酶 　　　　　0.1gm　　0.1%氯化钙（pH7.8）　　　100ml　　配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃（载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度）。该消化液时间约为5～30min。　　2．0.4%胃蛋白酶　　试剂：胃蛋白酶 　　　　　400mg　　0.1N HCl　　　　　　　　 100ml　　配制方法：同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。　　3．0.06% Pronase　　试剂：Pronase　　　　　　　0.06g　　0.05mol/L TB(pH7.5)　　 　100ml　　配制方法：同前。　　在免疫细胞化学染色中，有时经Formalin过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露 抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异，总之，在保持组织形态不被破坏的前提下，宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中，以第一种最为常用。　　七、其它　　1．蔗糖溶液　　免疫细胞化学中应用的蔗精，常用浓度为5%～30%。一般光镜研究，仅用20%蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）处理，以确保其良好的细微结构。　　（1）20%蔗糖液：　　试剂：蔗糖 　　　　　　　　　　20g　　0.1mol/L PB(pH7.5)　　　　 　　至100ml　　配制方法：先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。　　该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。　　（2）20%蔗糖-5%甘油：　　试剂：蔗糖　　　　　　 20g　　甘油 　　　　　　　　　5ml　　0.1mol/L PB　　　　　　至100ml(约95ml)　　配制方法：先用少许PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足PB至100ml，于4℃保存备用。　　该液主要用于电镜标本的处理，常浸泡过夜（其它浓度的蔗糖中常分别为2h左右）。　　蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小，应用较