寡核苷酸探针

寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是指用化学合成技术在体外合成的单链DNA，长度一般为30―50bp。寡核苷酸探针目前均由DNA合成仪合成。 在确定寡核苷酸探针的序列时，一定要使该探针能与靶核酸序列特异性结合，而与无关体外转录法制备tRNA探针原理图序列不会产生杂交反应。如果靶DNA或mRNA的序列是已知的，合成寡核苷酸的序列按照碱基互补原则很容易确定。如果仅仅知道氨基酸序列，探针的设计则较复杂，因为大多数氨基酸可以具有好几种密码子，即密码具有简并性。这时就应该选择密码简并性最小的氨基酸序列。在设计筛选寡核苷酸探针时应遵守以下一些原则： 1．长度一般为30～50个bp，过长者杂交时间较长，合成量低，过短者，特异性较差。 2．碱基中(G＋C)含量应在40％～60％，超出此范围则会增加非特异性杂交。 3。探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 合成的寡核苷酸探针与cDNA探针相比具有以下优点： (1)制备简易：寡核苷酸探针以核苷酸为原料，通过DNA合成仪短时间内即可合成，方法简便，不需要复杂的分子生物学实验条件。 (2)序列任定：可按照已知的某一特定目的或靶基因的核苷酸顺序合成任何一段特异性核苷酸片段用做探针。 (3)易穿透组织：由于寡核苷酸链不长，而且是单链，对组织的穿透力比较长的双链cDNA分子大。 (4)杂交时间短：由于寡核苷酸链短。其序列较简单，分子量小．所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。 (5)使用简便：合成的寡核苷酸探针性质上是脱氧核糖核酸，对RNA酶不敏感，因此比RNA探针更稳定；又因此类探针为单链分子，在与组织切片细胞内mRNA分子杂交时不需预先加热解链。 寡核苷酸探针也有一定缺点，如与mRNA的杂交不如RNA-RNA杂交稳定，再者，因其分子较短，一般只能采用末端标记法标记，结合的标记物较少，故其敏感性较低。此外，大量合成寡核苷酸探针所需费用较高。