牛初乳及其制品免疫球蛋白G的检测方法

关于牛初乳免疫球蛋白G（IgG）定量检测，国内外主要有：酶联免疫法（ELISA）、琼脂双向或单向免疫扩散法（RID）、免疫电泳法、高压液相色谱法（HPLC）等等。从实践角度考虑，目前单向免疫扩散法（SRID）和高压液相色谱法（HPLC）较为现实。 1、 单向免疫扩散法 辐射状免疫扩散（radial immunodiffusion，简称RID）又称单向琼脂扩散（single agar diffusion），是利用可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下出现肉眼可见沉淀物的现象，测定标本中各种免疫球蛋白含量的一种敏感性较高的定量试验。试验时，将适当浓度的已知抗体加入融化（45℃）的琼脂中，混匀后浇注于玻璃板，制成凝胶板。隔适当距离在凝胶板上打孔，加入被测可溶性抗原，使其向四周扩散，经一定时间后，抗原与琼脂中的抗体相遇，在比例适宜处即会生成白色沉淀线。基于沉淀环的直径与抗原浓度成正比，可以先用已知不同浓度的标准抗原制成标准曲线，再根据测试样品沉淀环直径的大小，从标准曲线上查出样品中抗原的相应含量 RID测定牛乳IgG的具体操作方式可参阅《规范》附录。其特点是易于在企业实验室内进行操作、检验。 RID测定牛初乳IgG目前最大的困难在于：无法获得标准化的专门检测牛初乳IgG的 试剂 盒，因此，按照上述方法，不同研究者、检测人员所得到的检测结果可能存在一定差异。此外，检测标准样品、抗血清制备时所采用的IgG来源均影响检测结果。 另外一种琼脂扩散类型为双向琼脂扩散（double agar diffusion），是将抗原和抗体分别加入一定间距的小孔内，使二者分别在琼脂凝胶中自由扩散。若抗原和抗体配对，浓度和比例适当（由于抗原较之抗体具有较大反应面积，故试验时需进行一定稀释），则一定时间后可以在抗原与抗体孔之间的凝胶中出现清晰的白色沉淀线。 2、 高压液相色谱法 这是国标GB/T 5009.194- 2003推荐使用的保健食品中IgG检验方法。因此，国家进出口商品检验检疫部门已经在2003年正式下达文件，规定采用该法检测牛初乳制品中免疫球蛋白G的含量。 该法特点是迅速，但是检测到的IgG可能包括样品中变性程度较深的那部分。新西兰Fonterra科学家Don Otter以及我们实验室的研究均证实，酪蛋白脱除对于该法获得准确检测结果具有重要意义。此外，Don Otter课题组已经正式向AOAC提交了相关论文。 色谱柱：牛初乳或免疫奶粉样品中的IgG可以采用亲合HPLC检测（Pharmacia Hi-Trap 蛋白质 G 柱），亲和介质为结合Protein G的琼脂糖（Sepharose 4B F.F.）。上述亲合材料已经通过基因工程手段剪切了Protein G中结合白蛋白的部位。 溶液配制： 1） 缓冲液A： 0.05mol.L-1磷酸二氢钠溶液（pH6.5）； 2） 缓冲液B: 0.05mol.L-1甘氨酸溶液（pH2.5）； 3）IgG贮液：sigma公司IgG配成浓度约4mg.mL-1溶液，冷冻浓缩至200mL。