抗体/补体介导的特异性细胞毒作用分离法分离T细胞亚群

抗体/补体介导的特异性细胞毒作用分离法分离T细胞亚群   人T淋巴细胞按其表面标志分为CD4+ T和CD8+ T细胞两类，其细胞膜上分别有CD4和CD8分子，当它们与相应的鼠抗人单克隆抗体结合后，在补体的参与下，可溶解相应的T细胞亚群，从而分离出另一种细胞亚群。   【试剂及配制】 （1）     聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）。 （2）     Hank’s液（内含5%小牛血清和1.0g/L叠氮钠）。 （3）     兔新鲜血清，肝素 （4）     抗CD4和抗CD8单克隆抗体。   【操作方法】 （1）     取肝素抗凝外周血，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液分离单个核细胞(PBMC),配成1´107 /ml细胞悬液； （2）     取1 ml细胞悬液与适量的抗CD4单克隆抗体反应，37℃孵育30min； （3）     用Hank’s液洗2次，1000r/min,10min,去除游离抗体； （4）     加入新鲜的适量的兔血清反应，37℃ 1h； （5）     离心1000r/min，10min，弃上清； （6）     用Hank’s液洗4次，获得CD8+T细胞,储存于4℃备用，并进行纯度和活力检测。  ** 同法可用抗CD8单抗代替CD4单抗，可获得CD4+ 细胞。   【结果分析】  用该法分离的T细胞亚群活力可达到95%以上，间接或直接免疫荧光技术检测分离T细胞亚群的纯度。 CD4+细胞 范围 80%～90% CD8+细胞 范围74%～95%   【注意事项】 （1）     采血后，应在2h内进行试验，且需在4℃中分离细胞，以保持细胞活力。 （2）     每次制备的鼠抗人T细胞单抗和兔新鲜血清效价并不一致，所以每次制备后均需经过预试验确定抗体和补体的稀释倍数。