免疫细胞化学染色操作规程

一、材料和试剂 1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。 2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。 3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。 4、0.01M  PH7.4  PBS 5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20） 6、AEC底物 （1）底物缓冲液（20X） PH 4.6 醋酸（分子量60.6）  30.6ml Triton -100 醋酸钠 3H2O（分子量136.1）66.68克 加蒸馏水到960ml，调PH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml （2）AEC（20X） AEC  15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中） （3）0.6% H2O2（20X） 临用时，（1）（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。 7、DAB（即DAB-4HCL） （1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X） （2）1M Tris（20X），用HCL调PH到7.4 （1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。 溶解后（可加热到500C），加水合氯醛 50克（水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或40C保存。 8、苏木素复染液    苏木素  1克    碘酸钠  0.2克    钾矾  50克    水    1000ml 9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。 10、3%H2O2：30% H2O2  1份，加9份双蒸水，临用时配。 11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板（见ICC protocol 04） 12、封片液：1克明胶，溶于30ml 350C水中，加入35ml        甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。 二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断） 1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或370C 10-15分钟，使恢复温度。 2、加3%H2O2，细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分覆盖住细胞。 3、室温10分钟后，甩掉H2O2，用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份，96孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。 三、封闭 细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置370C孵育30分钟后甩掉封闭液，不洗。 四、免疫化学染色 1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分覆盖细胞。37℃1小时或4℃冰箱过夜； 2、弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后，浸于100mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）3-5分钟，转入第二杯PBS（1000ml），如上法漂洗3-5分钟。擦干细胞片周围水分，96孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复3-4次； 3、加S.P试剂（S.P法，即放大法） （1）加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。37℃温和孵育30分钟； （2）按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干； （3）加已优选好浓度的S.P试剂，用量同“（1）”，37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干； 4、间接法加二抗（不放大法） 方法同S.P法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标记二抗。并省略（3）步骤； 5、加底物显色 （1）、加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/孔，细胞培养板50ul/孔，置于37℃恒温箱孵育5-10分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果（阳性对照显色程度为“+++” ），用自来水即可终止反应； （2）、复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液1-2滴，1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于PBS中约30秒钟返蓝色，最后在蒸馏水中漂洗。 6、封片 洗后细胞片擦去周围水分，滴加1滴甘油―明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。 五、结果判断 KSHV      阳性――诱导后BCBL-1细胞有10%-30%显红色，强度不一，未诱导BCBL-1阳性细胞（1-30%）            阴性――诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色（排除边缘效应） MCMV/HVMV      阳性――感染病毒的细胞有病灶反应，显红色，强度不一，未感染细胞不显红色（排除非特异性染色）                    阴性――感染细胞和未感染细胞不显红色 注意： 1、一抗、二抗的稀释采用1%BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS 2、整个反应过程在湿盒中进行（细胞片） 3、洗涤时应使用染色缸（细胞片） 六、说明 1、测血时一抗血清稀释度要求 项目        KSHV        MVMV        HCMV        其它 稀释度        1:50，1:100,1:200        1:50，1:100,1:200        1:100，1:500,1:1000        1:100，1:500,1:1000 可融合标准        1:100阳性时        1：100阳性        1：500阳性        1：500阳性 2、S.P法使用二抗的不同情况 项目        MCMV        HCMV        其它 样品        母克隆、亚克隆细胞培养上清        血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清        血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清 一抗为IgG型， Biotin标记二抗        Biotin-Anti mouse IgG F(ab`)2,SIGMA,CAT:B6774 一抗为IgM型， Biotin标记二抗        Biotin-Anti mouse IgGAM,ZYMED,CAT:62-6440 稀释度        1：200 3、间接法（不放大法）使用二抗的不同情况 项目        MCMV        KSHV 样品        血清        血清、母克隆、亚克隆细胞培养上清 一抗为IgG型， HRP标记二抗        HRP-Anti mouse IgG Fc,1:100,SIGMA,CAT:A-0168 一抗为IgM型， HRP标记二抗        HRP-Anti mouse POLYVALENT,1:100,SIGMA,CAT:A-0412 稀释度        1：100 4、对照系统，必须要做的对照系统如下： 阳性对照：标准一抗，阳性血清，阳性上清 阴性对照： （1）阴性一抗对照：小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液        （2）阴性抗原细胞对照：未感染病毒的细胞，每个待测及对照均须做阴性细胞对照      空白对照：不加一抗，用1%BSA替代      无关对照：与本项目无的第一抗体