HLA-I重链、轻链的制备（包涵体的制备）

HLA-I 重链、轻链的制备（包涵体的制备）   此步骤是用原核表达的方法制备HLA-I类分子的重链和轻链，其中重链为HLA-A2分子的α链（胞外段，包括α1至α3功能区），轻链为β2微球蛋白。HLA-A2分子的α链的C端连接有BSP（生物素结合部位），该部位是通过基因重组的方法将BSP序列与HLA-I类分子重链基因连接后，经过原核表达而获得。 【试剂及配制】 （1）LB培养基 （2）0.4M  IPTG （3）50mg/ml 溶菌酶 （4）1.0M  MgCl2 （5）2mg/ml DNA酶I，溶于50%甘油，75mM NaCl （6）Triton-X 100 （7）1M DTT （8）重悬液（PH8.0）50mM  Tris-HCl(PH8.0)25%(W/V) 蔗糖 1mM EDTA 0.1%(W/V) 叠氮钠 10mM DTT(新鲜加入) （9）洗涤液I(PH 8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)0.5% Triton-X 100 100mM NaCl 1mM EDTA 0.1% 叠氮钠 1mM DTT(新鲜加入) （10）洗涤液II(PH8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)100mM NaCl 1mM EDTA 0.1% 叠氮钠 1mM DTT(新鲜加入) （11）尿素溶液（PH6.0）25mM MES(PH6.0) (维持电解质溶液)8M 尿素 10mM EDTA 0.1mM DTT(新鲜加入) （12）HLA-A2重链、β2微球蛋白表达质粒，以及宿主菌。 【操作步骤】 （1）         挑取含有目的基因（HLA-A2重链、β2微球蛋白基因）表达质粒的宿主菌单克隆接种入100ml LB培养液。37o C水平振摇过夜。 （2）         每升含有抗生素的LB培养液中加入12ml饱和菌液,共6升。 （3）         37o C水平振摇至OD600 =0.6，取1ml菌液（未诱导），离心取菌体沉淀置-20℃冻存。余下的6L菌液中加入0.4M IPTG 6ml，至终浓度为0.4mM,进行诱导。 （4）         37o C水平振摇4小时，取0.5ml诱导后的菌液，离心取沉淀，置-20℃冻存。 （5）         诱导后的约6L菌液于4℃离心，4000rpm X 15分钟 （6）         沉淀重悬于60ml重悬液，分装在两个50ml离心管中，置-80℃冻存。 （7）         解冻菌液，倒入100ml烧杯，用磁力搅拌器中速搅拌。 （8）         边搅拌边滴入：1.2ml 50mg/ml 溶菌酶（终浓度=1mg/ml）                      300ul 1.0M MgCl2 (终浓度=5mM)                      1.0ml 2mg/ml DNA酶I(溶于50%甘油，75mM NaCl)                      600ul Triton-X 100（终浓度=1%）                      600ul 1M  DTT（终浓度=10mM） （9）         将盛有细菌裂解物的100ml烧杯置于冰浴中。 （10）      超声裂菌：将探头插入菌液，使其深度最大，但不要接触烧杯的底部。 （11）      将超声裂菌器裂菌1.5分钟，每次间隔0.5秒。 （12）      转移菌液至3个25 X 89mm Beckman 离心管中，在Beckman Cs-15R离心机中用FO 630 转头，以最大速度于4℃离心10分钟。 （13）      取50ul上清，标记为S1 ,置-20℃冻存。 （14）      弃上清，加1-2ml洗涤液I。 （15）      用搅拌棒将沉淀打散，加洗涤液I至15ml，继续搅拌直到沉淀完全分散。 （16）      置冰浴，用超声裂菌器裂菌1.5分钟，每次间隔0.5秒。 （17）      重复步骤（12）至（16）。 （18）      取50ul上清，记为S2 ，余弃去。 （19）      重复洗涤3次，取上清,记为S3 - S5 （20）      同上法，用洗涤液II悬浮沉淀。 （21）      同上法离心，4℃，10分钟。 （22）      弃上清，沉淀重悬于200-1000μl 双蒸水，一旦白色浆状物形成，立即重悬沉淀于10-30ml尿素溶液中。 （23）      4℃，10分钟，离心包涵体。 （24）      转移上清至15ml离心管。 （25）      取2μl包涵体，加98ul尿素溶液稀释，测240nm-320nm的OD值。 （26）      计算蛋白浓度，取500-10000nmol蛋白，置离心管中。 （27）      在液氮中速冻，并保存于-80℃ （28）      将各时期的样品行SDS-PAGE(10-12%)。共8个样品：诱导前，诱导后，S1 - S5 最终包涵体样品。