PCR-SSO预杂交和杂交

PCR-SSO 预杂交和杂交   【材料和试剂】 （1）         50 X Denhardt：2.5g聚蔗糖400，2.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），2.5g牛血清白蛋白（BSA），加蒸馏水250ml。 （2）         预杂交液：5XSSPE，5Xdenhardt液，0.5%SDS，100ug/ml变性并裂解的鲑精DNA。 （3）         50%甲酰胺 （4）         10 X SSPE（p H 7.4）：100mmol/L NaH2PO4，1.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA。 （5）         固定有样本DNA的尼龙膜 （6）         标记的SSO探针 （7）         杂交炉或杂交袋 （8）         恒温水浴摇床（80rpm，有盖，温度可调至65℃） （9）         精确温度计（精度为±0.1℃） （10）      可调加样器（1～20ul，20～200ul，200～1000ul）   【操作步骤】 预杂交和杂交可以在杂交炉或杂交袋中进行。 （1）         将固定有样本DNA的尼龙膜用2XSSPE浸润后放入杂交管或杂交袋中，有重叠时应用专用筛网隔开； （2）         加入预杂交液：用杂交袋时，按每平方厘米0.2ml计算；用杂交管时，加入的杂交液以旋转时杂交管中的尼龙膜被覆盖为准。注意不能有气泡存在于液体之中； （3）         42℃预杂交10分钟至1小时； （4）         取出杂交袋或杂交管，在上述预杂交液中加入标记的SSO探针进行杂交，加入探针量为1ul/ml（预）杂交液； （5）         42℃杂交1小时至过夜。   【注意事项】 （1）         如果杂交液中不含甲酰胺，杂交应在68℃进行，此时杂交较为严格。 （2）         在预杂交和杂交过程中，尼龙膜接触（或覆盖）的杂交液中应该无气泡。 （3）         放射性物质的操作应严格遵守有关规定和采取适当的防护措施。